不同处理对猪精子蛋白泛素化影响的研究.pdfVIP

畜牧与兽医2014年第46卷第6期 ·63· 不同处理对猪精子蛋白泛素化影响的研究 李蒙蒙，董海涛，田宇，崔晶晶，金一4 (延边大学农学院，吉林延吉133002) 摘要：本研究旨在探究猪精子不同处理对精子泛素化蛋白表达量的影响。利用sDs—PAGE、westemblot技术，分析鲜精、冷休克、获能、顶体 ku、30ku、12 反应总蛋白种类以及猪精子泛素化蛋白表达量的变化。结果显示：约在41 ku处的蛋白发生了泛素化；冷休克处理组蛋白泛素化的 程度较其他三组明显下降；获能和顶体反应处理组要比鲜精处理组蛋白泛素化水平高。结论：低温处理精子可能导致泛素化蛋白降解或改变，使 泛素一蛋白酶体通路可能受阻；获能和顶体反应处理组泛素化程度比鲜精和冷休克处理组高，精子获能后可能泛素一蛋白酶体通路加强。 关键词：泛素一蛋白酶体通路；鲜精；冷休克；获能；顶体反应 中图分类号：S828 文献标志码：B 文章编号：0529—5130(2014)06—0063—03 2 泛素一蛋白酶体通路(uPP)在细胞分化、细胞h内带回实验室，用于试验的精液必须符合以下条 周期调控、细胞凋亡、免疫反应等一些细胞的基本过 件才可用于试验：①颜色应为乳白色；②精子活力至 程中起着重要的作用¨‘2J，并与许多疾病的发生发展 80％，③精子顶体完整性≥75％。 密切相关。因此对该系统的调节及其意义的研究已成 1．1．2药品及仪器 为当代研究的一个热点。uPP是选择性的将蛋白质降 本试验所用试剂除特殊说明外，均购自Sigma公 解，目前有关uPP在雄性生殖中的研究主要集中在 精子发生不同阶段泛素、泛素化蛋白、连接酶及蛋白 司；DAB底物显色液购自中杉金桥试剂公司；标准 水解酶复合体表达的变化上，泛素尤其在精子变态过 程所涉及的细胞问的相互作用、蛋白转换及染色质结 购于碧云天生物技术研究公司；免疫印迹一抗 构变化中起重要作用一。J。近来的研究证实了26s蛋 (RabbitAnti—ubiquitinPolyclonal 白酶体水解泛素化的精子蛋白质是成功受精的必要条 华夏远洋生物科技有限公司、二抗(Anti—RabbitIgG 件∞j，精子蛋白质泛素化不仅与获能期间发生顶体 Peroxidase Conjugate)购于Sigma公司。 反应有关，也与精卵结合并使精子穿过透明带的相互 本试验所用的仪器主要有垂直电泳槽、转移电泳 作用有关。然而，对于精子获能后，蛋白的泛素化程 仪、转膜仪等。 度是否加深以及精子因低温的损伤而造成“获能样” 1．2方法 变化1对蛋白泛素化程度有何影响的报道甚少。为 1．2．1鲜精处理 了研究“获能样”精子因低温处理可能导致UPP通 精液取回后在室温下平衡30min，用PBS对鲜 000 路受阻而无法真正获能的机理，本文主要对猪精子进 精液进行1：1(v／v)混合，3r／min离心3min， 行不同处理(鲜精、冷休克、获能、顶体反应)，用 弃上清液，再如此反复2次留沉淀待用。 westem blot法，探究精子泛素化蛋白表达量的变化， 1．2．2精子的获能处理 以期从分子生物学角度探索精子冷冻损伤的机制。 精液取回后在室温下平衡30min，用PBs对鲜 000 精液进行1：1(v／v)混合，3r／min离心3min， 1材