克隆基因的步骤及其注意事项.doc

克隆基因的步骤 姓名：王静 马红梅 施翔骞 武洋 梁丹 罗星（指导老师） 克隆基因的步骤 摘要：基因是遗传物质的最基本单位，也是所有生命活动的基础，不论是揭示某个基因的功能还是要改变某个基因的功能，都必须将所要研究的基因克隆出来。本文将试验中的体会以及查阅文献后获得的知识做一汇总，简述克隆基因中的步骤以及在操作中应该注意到的一些问题。 关键词：基因克隆；质粒；重组 基因克隆可概括为∶分、切、连、转、选。分是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；切是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；连是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；转是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；选则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。　克隆的第一步是获得包含目的基因在内的一群DNA分子，常用的方法有机械切割和核酸限制性内切酶消化。如果基因的两端部分序列已知，根据已知序列设计引物，从基因组DNA 或cDNA中通过PCR技术可以获得目的基因。 接下来选择载体，本次试验采用的是质粒载体，利用质粒进行载体构建。载体构建的原理为：依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。 体外重组则可完成上述过程。体外重组即体外将目的片断和载体分子连接的过程。大多数核酸限制性内切酶能够切割DNA分子形成有粘性末端，用同一种酶或同尾酶切割适当载体的多克隆位点便可获得相同的粘性末端，粘性末端彼此退火，通过T4 DNA连接酶的作用便可形成重组体，此为粘末端连接。当目的DNA片断为平端，可以直接与带有平端载体相连，此为平末端连接，但连接效率比粘端相连差些。有时为了不同的克隆目的，如将平端DNA分子插入到带有粘末端的表达载体实现表达时，则要将平端DNA分子通过一些修饰，如同聚物加尾，加衔接物或人工接头，PCR法引入酶切位点等，可以获得相应的粘末端，然后进行连接 其次，将外源重组DNA分子导入原核宿主细胞的方法有转化，转染转导重组质粒通过转化技术可以导入到宿主细胞中 从不同的重组分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子即阳性克隆的过程就是筛选。目前发展起来的成熟筛选方法如下：提取转化子中的重组DNA分子作模板，根据目的基因已知的两端序列设计特异引物，通过PCR技术筛选阳性克隆。PCR法筛选出的阳性克隆，用限制性内切酶酶切法进一步鉴定插入片段的大小。 上述方法获得的阳性克隆最后要进行测序分析，以最终确认目的基因。 PCR反应参加PCR反应的物质主要有五种即引物(PCR引物为DNA片段、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。 取一管-80℃保存的感受态细胞，置冰上融化一次转化感受态细胞的用量为50-100ul,应注意所用DNA体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。加入连接物（50ul的感受态细胞能够被1ng超螺旋质粒DNA所饱和），轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴30min；将离心管置于42℃热击60-90秒，然后迅速置冰浴2-3分钟，该过程不要摇动离心管；向每个离心管中加入500ul液体LB培养基，混匀后置于37℃摇床振荡培养45分钟（150转/分钟）；目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏? 将离心管内容物混匀，吸取已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的LB固体琼脂培养基上（含），用无菌的弯头玻棒轻轻将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16小时。至红、白斑区分明显为止。涂布用量可根据具体试验来调整：如转化的DNA总量较多，可取更少量转化产物涂布平板；反之，如转化的DNA总量较少，可取转化产物涂布平板。如果预计的克隆较少，可通过离心（4000rpm,2min）后析除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。（涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的培养板）注意事项：1、感受态细胞应保存在-70℃，不可多次冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。2、进行转化操作时，应根据相应温度及无菌条件的要求进行3、为防止转化试验不成功，可以保留部分连接反应液，以重新转化，将损失降到最低。4、：使用前用无菌纯水配制母液’-磷酸以抑制DNA片段的自身环化。 通过以上步骤可获取基因，并构建载体，完成对基因的进一步研究。 参考文献： 戚金亮,马小娟,王丽,印莉萍,韩振海.??常规PCR与RACE结合