免疫酶技术.ppt

免 疫 酶 技 术 基 本 原 理 免疫标记技术（immunolabelling technique）:是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。 特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位 分类：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定。 免疫酶技术(enzyme immunoassay)：是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。 实验一： ELISA方法检测人血清中IgG 酶联免疫吸附试验 enzyme linked immunosorbent assay, ELISA 是一类常用的免疫酶技术。是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。 常用的酶：辣根过氧化物酶(HRP) 碱性磷酸酶（AP）。 常用的方法：间接法、双抗体夹心法和抗原竞争法。 目的： * 掌握ELISA技术 * 检测血清中IgG含量 材料： 抗人IgG抗体（羊抗人IgG抗体）（一抗） 已知IgG含量的参考蛋白（作标准系列） 待检人血清 辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体（二抗） 包被液：PH9.6 0.05mol/L碳酸盐缓冲液 洗涤液：PH7.4 0.01mol/L PBS 底物溶液：OPD-H2O2 终止液：2mol/L H2S04 酶标反应板（一排/人） 操 作 步 骤 包被（用一抗包被）（已做） 洗涤3次(将洗液加入每孔，1min后倾去) 加样：将已知含量的参考蛋白IgG配比稀释7孔，第8、9孔加待检血清，第10孔作空白对照（100ul/孔）。 孵育（37℃ 40min） 洗涤3次 加酶标记的抗人IgG抗体（即二抗）(100ul/孔) 孵育（37℃ 30min） 洗涤3次 显色（加底物溶液，100ul/孔。室温避光15-30min） 终止反应 检测(490nm波长下检测) 结果观察与分析： 空白对照应无色； 阳性孔呈棕黄色， 标准系列各孔呈明显的颜色深浅梯度； 绘制标准曲线。 注意事项： 做配比稀释时，应从高浓度到低浓度； 显色时一定避光； 检测时应避免孔中有气泡。 实验二 APAAP法检测淋巴细胞亚群 用抗人T细胞CD的McAb与T细胞反应，用羊抗鼠IgG搭桥，其中一Fab连接抗T的McAb， 另一Fab连接APAAP，再由复合物中的AP催化底物显色来判断CD分子的存在，从而确定T细胞的各亚群。 目 的： T细胞亚群检测 材 料 APAAP 试剂盒（含CD3、 CD4 、CD8 McAb） TBS缓冲液 Mayer苏木精复染液 纯丙酮 鼠抗人T亚群单克隆抗体（一抗） 羊抗鼠IgG（二抗） 操 作 步 骤 1．分离PBMC，PBS调整PBMC浓度。（已做） 2．甩片，固定，干燥，标记。（已做） 3.加一抗（鼠抗人）10ul。 37℃湿盒孵育，30 min；PBS浸洗5min，擦片 4.加二抗（羊抗鼠） 10ul。 37℃湿盒孵育，30 min；PBS浸洗5min，擦片 5.APAAP复合物10ul（鼠抗AP）. 37℃湿盒孵育，30 min；PBS浸洗5min，擦片 6．碱性磷酸酶底物显色， 37℃湿盒孵育，30 min；PBS浸洗5min，擦片 7．Mayer苏木精复染1min，自来水冲洗 8．高倍镜下观察 结果观察： 阳性细胞：细胞膜上或胞浆着色为红色 阴性细胞：细胞膜上或胞浆着色为无色 计数阳性细胞百分率（100-200个） 正常值： CD2 、CD3阳性细胞： 60-80% CD4阳性细胞： 35-55% CD8阳性细胞： 20-30% CD4/ CD8比值：1.5-2.0 注意事项： 擦干细胞周围的水分，以防圈内所加试剂流散； 甩片前最好加入1%的BSA，起固定作用 * Indirect ELISA Sandiwich ELISA Competitive ELISA 100ul 稀释液 待测血清 PBS-T20 100ul 标准品 100ul 100ul 实 验 原 理 优点： * 不经化学交联反应，避免了抗体和酶活性降低。 * 省去酶标记抗体需纯化的繁琐过程。 * 标本易于检测，保持时间长。 应用：* 淋巴细胞分化抗原； * 活化抗原； * MHC-Ⅰ、Ⅱ类抗原表达的检测。 * * * * *