基因工程实验纲要.doc

实验项目 实验一 大肠杆菌基因组提取及电泳 实验二 大肠杆菌质粒DNA的转化 实验三 质粒DNA的提取及电泳 实验四 PCR扩增目的基因及电泳 实验五 质粒DNA的酶切及电泳 实验一 大肠杆菌基因组提取及电泳 【实验目的】：学习CTAB法提取大肠杆菌基因组的操作方法，熟练并掌握琼脂糖凝胶电泳的原理及使用方法。 【实验原理】： CTAB是一种阳离子去污剂可以溶解细菌细胞膜，并且在低离子浓度溶液中沉淀核酸和酸性多糖，在高离子浓度条件下（大于0.7mol/L NaCl）а菌种。 【实验步骤】： 1. 收集2ml 培养至对数生长期的大肠杆菌菌液，12000转/分离心3分钟，弃上清。 2. 加入190ulTE(水）缓冲液悬浮沉淀，加10ul 100g/L SDS, 1ul 20mg/ml 蛋白酶K,混匀，37度温浴1h. 3.加入30ul 5mol/L NaCl, 混匀。 4. 加入30ul CTAB/ NaCl溶液，混匀，65度温浴20min. 5.加入300ul 酚/氯仿/异戊醇抽提，12000转/分 离心5分钟，取上清至新1.5ml dorf管. 6.重复上步。 7.加入300ul 异丙醇，颠倒混匀，室温静置10分钟，沉淀DNA. 8.12000转离心5分钟，去上清，500ul 70%乙醇洗涤后12000转离心5分钟，弃乙醇吸干。 9.溶解于20ul无菌水或TE缓冲液中，取3ul进行琼脂糖凝胶电泳。 10. 1%琼脂糖凝胶电泳的制备 1）．选好胶板插好梳子。 2）．称取0.5g 琼脂糖 溶于50ml TAE缓冲液中。 3）．在微波炉中80火力溶解，溶解后冷却，不烫手时加入1ul的EBr倒入胶板中赶走气泡，使其凝固。 11.电泳 1）. 取3ul 基因组DNA加入3 ul 6X loading buffer, 混匀。 2）. 将梳子拔下，点样后通电进行电泳。 3）. 紫外凝胶仪器中观看电泳结果。 实验二 大肠杆菌质粒DNA的转化 【实验目的】：学习大肠杆菌转化的操作过程，掌握细菌质粒转化的实验原理。 【实验原理】：当细菌处于容易吸收外源DNA的状态时，为感受态，低温时质粒容易与感受态细胞吸附，经升温热刺激后被感受态细胞吸收，转化后的细菌在加入相应抗生素的培养基上过夜培养即可得到单菌落。 【实验仪器及材料】： 37度恒温培养箱、37度恒温振荡摇床、无菌操净台。 【实验步骤】： 1. 将2ul重组质粒加入到200μl DH5a感受态细胞中，轻轻旋转，混匀内容物，冰浴30 min。 2. 将1.5μl EP管放入预加热的42oC水浴锅中，恰恰放置90 s，热休克时不可摇动EP管。 3. 迅速将EP管移到冰中，使细胞立即冷却2 min。 4. 加入500μ LB培养液，37oC(160-225) rpm摇床培养1 h。 5. 将管中液体全部取出涂布于含相应抗性的LB培养基平板上37oC温箱培养12-16 h。 6. 次日，观察是否有菌落长出。 实验三 质粒提取及电泳 【实验目的】：学习质粒提取原理及操作步骤，熟悉质粒的琼脂糖凝胶电泳。 【实验原理】：碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不性而呈絮状，离心时可沉淀质粒一般有三种构像，即超螺旋，开环超螺旋，线形和开环。（开环质粒是指双链环状的质粒DNA有部分解链，因此电泳速度最慢）三种构像的质粒在琼脂糖电泳的前后顺序是超螺旋开环а培养液。 【实验步骤】： 质粒提取 1. 收集菌体2ml, 12000 rpm，离心2 min，弃上清液。 2. 加入150 μl SolⅠ(含Tris, EDTA, 葡萄糖)重悬菌体，可用枪头吹打悬浮。 3. 加入150 μl SolⅡ(0.2 M NaOH,，1%SDS(m/v)，需要现用现配，将0.4 M NaOH溶液和2%SDS溶液等体积混合)，小心轻混，缓慢上下颠倒2－3次。此时溶液呈黏稠状。 4. 加入150μl SolⅢ（冰醋酸，醋酸钾） 小心轻混，缓慢上下颠倒2－3次。有白色絮转沉淀。 5. 12000 rpm，离心3 min。，取上清液。加入等体积(大约450μl)酚/氯仿/异戊醇（使用时要注意用枪头吸下液面部分）振荡混合。此时溶液呈乳浊状。 6. 12000 rpm，离心3 min，取上清液。加入2倍体积无水乙醇(约900 μl或1 ml)，置于-20 oC醇沉10min。 7.12000 rpm，离心3 min，弃乙醇。加入1 ml 70%乙醇，12000 rpm，离心3 min，弃掉溶液，自然干燥15 min。注意保持质粒的湿润。 8. 加入30μl灭菌水