CHO细胞无血清结团灌流培养：超声-沉降柱二合一灌流系统.pdfVIP

中国生物工程杂志 China Biotechnology，2008，28(4)：53～58 CHO细胞无血清结团灌流培养： 超声．沉降柱 二合一灌流系统 李 智 肖成祖 杨 琴 黄小乐 梁倩茹 陈小飞 郑敦武 陈晓铭 (广州铭康生物工程有限公司 广州 510730) 摘要 利用CHO细胞能在培养过程中自然结团的特性，采用超声一沉降柱二合一灌流系统能促 进细胞结团和加强截留的特性，用无血清培养基连续灌流培养基因重组CHO细胞MK3-A2株，分 泌表达rhTNK-tPA获得了成功。培养周期为77～ll0天，细胞结团率为90％左右，直径在285～ 570 m之间，细胞截留率保持在95％左右，成活率为85％以上，细胞密度达到2×10 ／ml左右， rhTNK4PA生产率平均为89 mg／L／d，最高时达216mg／IVd。结果表明，使用该灌流系统进行细胞 结团培养可以取代微载体培养用于动物细胞制药的规模化生产。 关键词 结团培养 无血清培养基 CHO细胞 rhTNK-tPA 超声一沉降柱二合一灌流系统 中图分类号 Q813．1 利用搅拌式生物反应器进行批次或批次一补料的 1 材料与方法 规模化细胞培养，是当前生产基因工程药物的主要方 式。随着工程化单克隆抗体的出现和应用的日益广 1．1 细胞株 泛，原来的生产工艺已成为阻碍产量迅猛增长的瓶 用以生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变 颈…，改用连续灌流的培养方式已越来越受到重视。 体(recombinant human tissue—type plasminogen activator 因为它在节省设备投资和提高生产效率等方面有着明 TNK mutant，rhTHK—tPA)的CHO工程细胞MK3一A2由 显的优势口 。为了方便地实现灌流培养中的细胞截 本公司构建 】，经亚克隆获得的稳定株，经过2个月的 留，最常用的方法是采用微载体培养，并通过过滤或沉 驯化培养已能适应无血清悬浮培养，表达量为7008 降的方法使细胞和培养基分离。但微载体本身价格昂 IU／10 ／d，倍增时间约为30~40h。 贵，成本高，操作及处理复杂，为此，采用细胞的结团培 1．2 培养基 养已开始引起人们的兴趣 ，4 。 基础培养基为DMEM与F12(1：1)(Gibco公司产 如何使细胞迅速地、良好地结团，以及如何能长期 品)，通过补充部分氨基酸，如天冬氨酸、谷氨酰氨和苏 截留细胞进行灌流培养是能否将结团培养工艺真正用 氨酸等，再添加叶酸、柠檬酸铁和硫酸锌等(以上均为 于规模化生产的关键。本试验中，我们既利用了CHO Sigma公司产品)构成无血清培养基。 细胞在培养中能自然结团的能力，又设计了一套超 1．3 超声-沉降柱二合一灌流系统 声—沉降柱二合一的灌流系统，已申请发明专利 ，它 由荷兰Applikon公司的BioSep超声分离装置中的 不仅可以进一步促进细胞结团，而且能有效地截留细 超声室及其控制系统，与本公司自制的重力沉降柱及 胞进行长期灌流培养，试验结果令人满意。 其控制系统 结合在一起所组成。 收稿日期：2008-01-08 修回日期：2~8-01—16 如图1所示，超声室①为原来的BioSep超声细胞 {通讯作者，电子信箱：yangqinl6@hotmail．corn 分离器的一部分，外面有外套使超声室降温，侧面有接 54 中国生物工程杂志China Biotechnology Vo1 ． 28 No．4 2008 线与超声功率