4-动物肝脏DNA提取 - 质量工程.DOC

　实验教学教案首页 本次实验项目： 　　　　　　　　动物肝脏DNA的提取及检测 本次实验课时：10学时 实验类型：综合性 教学要求： 1．掌握实验原理 2．知道提取DNA要去的物质……………………………………………………………　　……　 0.1 学时 2．实验目的…………………………………………………………………　　… 0.3学时 3．实验原理……………………………………………………………………　　 0.3 学时 4．实验操作　　　　　……………………………………………………　　… 0.3 学时 实验教学 动物肝脏DNA的提取及检测实验的操作技术………………………　　……　 　9　学时 参考资料 《分子生物学实验》 综合性、设计性实验基本信息表 学院名称 生物科学与工程学院 实验室名称 生物化学实验室 课程名称 生物化学 面向专业 生物科学、生物技术 实验名称 动物肝脏中DNA的提取及检测 大纲规定 学时数 10 实验性质及依据 实验性质（√） □综合性√　　□设计性 实开学时数 10 实验目的： 根据教师提供的实验条件，了解并掌握提取基因组DNA的原理和技术。能够从动物肝脏中提取DNA粗品，并能够用琼脂糖凝胶电泳法检测所提DNA。对实验结果做出正确定的分析。 实验要求： 根据教师给准备的实验材料、实验仪器和试剂，结合实验目的进行整个实验过程在实验前做好预习； 做好每步实验结果的记录，根据原始记录，对实验结果做出正确分析，写好实验报告； 写出本实验成功与失败的原因。 实验内容： 第一部分：动物肝脏中DNA的提取 第二部分：DNA琼脂糖凝胶电泳 认定依据：本实验内容涉及本课程综合知识琼脂糖凝胶 盖章 年 月 日 动物肝脏DNA的提取及检测（综合性） 相关知识 1．蛋白质变性作用，变性剂和酶的抑制剂 2．EDTA、SDS、蛋白酶K的作用、DNA的理化性质：溶解特性 ３．影响电泳迁移率的因素 ４．核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 　　　　　　　 琼脂糖浓度与DNA分离范围 琼脂糖浓度 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 线状DNA大小/kb 5-60 1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-4 0.1-3 ５．核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环DNA＞直线DNA＞开环的双链环状DNA。 ６．琼脂糖凝胶天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80%）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下。琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98%~99%），近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。DNA（RNA）定量 分析可用紫外光谱分析，原理是DNA（RNA）分子在260 nm处有特异的紫外吸收峰，且吸收强度与DNA(RNA)的浓度成正比。此外，还可通过琼脂糖凝胶电泳上显示的DNA（RNA）带的亮度来分析，因为EB 作为一种荧光染料，能插入DNA(RNA)的碱基对平面之间而结合于其上，在紫外光的激发下产生荧光，DNA(RNA)分子上EB的量与DNA分子的长度和数量成正比。在电泳时加入已知浓度的DNA（RNA）Marker作为DNA（RNA）分子量及浓度的参考，样品DNA(RNA)的荧光强度就可以大致 表示DNA（RNA）量的多少。 ①基因组DNA的特性：分子量较大、DNA片段的大小：100 — 150kbDNA分子的完整性？） 组织和细胞的破碎要去的物质：RNA和小分子物质Southern杂交、基因组DNA文库的构建g（0.2g）鸡肝，（冰冷生理盐水洗3次），剪碎(速度要快) 碎鸡肝转入预冷的玻璃匀浆器中，加入2mL匀浆液（含EDTA），匀浆 （低温操作，至少5－6次，直到无大块的组织存在） 匀浆液转入2mL小离心管（转管前先静置一会，防止未碎的大块的组织进入2ml管） 40C , 5000rpm离心1~2min（离心要平衡，对称） 弃上清，沉淀（细胞）加0.4mL无菌水，用枪吹散，再加0.4mL酶解液（含SDS、蛋白酶K） 慢慢颠倒混匀， 55℃ 水浴酶解