对布鲁氏菌虎红平板凝集实验方法的改进.docx

对布鲁氏菌虎红平板凝集实验方法的改进-----虎红平板实验LED工作台的使用一、技术领域：兽医领域布动物鲁氏菌病的筛查诊断、布鲁氏菌疫苗免疫后抗体监测；以及公共卫生领域人布鲁氏菌病的筛查诊断。二、背景技术： 布鲁氏菌病是一种人兽共患传染性病，过去主要在北方流行，进入2000年后随着养殖业的发展，传播范围逐步扩大，现在已经波及全国。该病是由布鲁氏菌感染引起的，一般由患病的牛、羊、猪等家畜传染给人。家畜患布鲁氏菌病病常常出现流产、不孕、空怀、繁殖成活率降低，使牲畜头数明显减少，产肉、产奶量下降，直接影响着畜牧业的发展和农民致富。人得布病后急性期全身困倦、四肢乏力，全身肌肉关节游走性疼痛，反复发热，体温可达39-40；多汗，特别是晚上或凌晨退热时大汗淋漓，个别人会出现肝脾肿大、淋巴结和睾丸肿大，女性有卵巢发炎、月经不调等妇科疾病的症状。发展为慢性期后细菌侵入人体各个部位，引起各器官组织发生病变，影响劳动力和生活质量，严重的可造成劳动能力和生育能力的丧失。布病在急性期有可能治愈，一旦发展为慢性则无法医治，终身携带。布鲁氏菌病的诊断以血清学诊断为主，基层常见的布鲁氏菌病诊断及免疫后抗体检测方法为虎红平板凝集试验（RBPT）。此实验价格便宜，操作方便，检测快速，非常适于群体布鲁氏菌病的普查，而且在国际贸易中是牛、羊、猪布鲁氏菌病检测的指定试验，在我国也用于人布鲁氏菌病监测的初筛。检测布鲁氏菌病所用的虎红平板凝集抗原是用抗原性良好的布鲁氏菌菌株经培养，灭活，离心收集菌体用虎红染料染色后，悬浮于乳酸缓冲液中制备而成。试验原理：使用商品化（PH3.6-3.9）带色的布鲁氏菌抗原与被检血清作用混合，如果待检血清中含有布鲁氏菌抗体，则发生抗原抗体凝集反应，肉眼观察会产生絮状沉淀，此时判定为抗体阳性。如待检血清中不含布鲁氏菌抗体，则不发生反应，肉眼观察混合液体清亮，判为阴性。虎红平板凝集试验具体方法如下：（一）材料准备1.虎红平板凝集抗原、标准阳性血清、阴性血清由制标单位提供，按说明书使用。注：标准抗原、标准阳性对照血清、阴性对照血清。2.被检血清应新鲜，无明显蛋白凝块，无溶血和无腐败气味。注：待检血清3.洁净的玻片或玻璃板，其上划分成4cm2的方格。4.使用微量移液器、牙签或火柴杆。（二）操作方法1.实验前，应将血清和抗原在室温放置30-60min。2.将玻璃板上各格标记被检血清号，然后加相应被检血清30μL。3.在被检血清旁滴加虎红平板凝集抗原30μL。4.用牙签类小棒搅动血清和抗原，使之充分混合，在4分钟内观察结果。5.每次试验应设阴性血清、阳性血清对照。（三）结果判定1.在阴、阳性血清对照成立的条件下，方可对被检血清进行判定。2.受检血清在4min内出现肉眼可见凝集现象者判为阳性(+)，无凝集现象，呈均匀粉红色者判为阴性(-)。注：阴性反应结果 阳性反应结果虎红平板凝集实验检测布鲁氏菌病，方法简便、快速、价格便宜、容易操作，适于基层大面积检疫。但在使用过程中，我们发现这种方法存在着准确性较低的缺点。主要原因是人眼观察时灵敏度较低，再受到环境中照明条件的影响，在絮状沉淀较少时不易发现，从而造成误判。通过实验我们发现，在虎红平板凝集实验的结果判定过程中使用灯箱，可以有效提高判定的准确率。注：将反应板置于灯箱之上，可以比较清楚的看到阳性反应中絮状沉淀。但是传统的日光灯管灯箱有很多缺点：首先有这种灯箱有明暗交界区，给结果判断带来一定影响；其次，日光灯管灯箱亮度太大，且不可调整，经常直视会对使用者的视力造成影响；第三是日光灯管灯箱形状和厚度的限制，在日常实验室使用时不够方便。LED灯箱的出现给我们带来了新的思路。LED灯亮度均匀，不存在明暗交界区，而且亮度可调整到人眼比较舒适的范围，厚度上可以做的很薄。基于上述优点，我们考虑使用LED灯箱作为虎红平板实验工作台，直接在灯箱上做虎红平板实验。我们发现用玻璃板进行实验时，一旦玻璃破碎容易对操作人员造成伤害，另外本实验使用的待检血清可能来源于布鲁氏菌病患病动物，玻璃一旦划破操作人员皮肤，极易造成人员感染布鲁氏菌病，因此我们在实际操作中使用硬质透明塑料胶片（学生用塑料光面垫板）代替玻璃板进行实验操作，有效降低了操作人员的感染风险。硬质透明塑料胶片价格便宜，因此可以一次性使用，使用完毕后经消毒处理直接可以丢弃，也避免了玻璃板清洗消毒重复使用中间造成劳动量的增加和感染风险的增加。三、使用方法将LED灯箱放置于实验室工作台之上，连接电源后将灯的亮度调整到操作者眼观比较舒适的亮度；在其上覆盖透明塑料薄膜（防止液体试剂流入灯箱），然后直接放置玻璃板或者硬质透明塑料胶片，在其上做虎红平板实验，边操作边观察判断结果。也可在实验室工作台上做实验，然后把玻璃板或者硬质透明塑料