基因工程知识点总结归纳更新版.docVIP

基因工程 绪论 克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。作动词：基因的分离和重组的过程。 基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。 基因工程诞生的基础 三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。 三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现 基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达； 基因工程的工具酶 限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数 3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割 4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。 5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。 6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。 7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。 8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。 9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。 10、RNAH降解与DNA杂交的RNA，用于cDNA文库建立时除去RNA以进行第二链的合成。 11、DNA聚合酶： (1)、DNA聚合酶I：5’—3’外切酶活性、3’—5’外切酶活性，5’—3’聚合酶活性，用途：除去3’端突起。补齐5’端突起。合成cDNA第二链。切口移位探针的制备。 (2)、Klenow大片段：没有5’→3’外切酶活性，而保留了5’→3’DNA聚合酶活性和3’→5’外切酶活性。用途:用同位素标记具5’端突起的DNA片段末端。补平5’粘性末端。DNA序列测定。合成cDNA第二链。 (3)、Taq酶：75度为最适反应温度，95度仍具有稳定性，不具有外切酶活性，主要用于PCR。 主要修饰酶： (1)碱性磷酸酶：除去核酸分子3’和5’端的磷酸基团。 (2)T4多聚核苷酸磷酸激酶：催化ATP中的γ位的磷酸基转移5’-OH上 (3)末端脱氧核苷酸转移酶：在3’端高效添加脱氧核苷酸。 分子克隆载体 分子克隆载体：是一类可供外源DNA片段插入并携带重组分子进入宿主细胞进行扩增或表达的DNA分子。 分子克隆载体的功能： 为外源基因提供进入受体细胞的转移能力 为外源基因提供在受体细胞中复制或整合的能力 为外源基因提供在受体细胞中扩增和表达的能力 载体的分类： 按用途分：克隆载体、表达载体、整合载体 按来源分：原核生物载体：质粒载体、λ噬菌体载体、M13噬菌体载体、cosmid载体、phagemid载体；真核病毒载体 载体的特点： 至少有一个复制起点，因而至少可在一个生物体中自主复制 至少有一个克隆位点，可供外源DNA插入 至少有一个标记基因，以知识载体或重组DNA分子是否进入受体细胞 具有较小的分子量和较高的拷贝数 标记基因的作用：外源基因是否插入载体分子形成重组子；外源载体是否进入宿主细胞 标记基因的种类：抗性标记基因；营养标记基因；生化标记基因；噬菌斑 常用的遗传标记基因：四环素抗性基因（Tc）；氨苄青霉素抗性基因（Ap）；氯霉素抗性基因（Cm）；卡那霉素（Kan）；新霉素（Neo）；β—半乳糖甘酶基因（LacZ)；葡萄糖苷酸酶基因（Gus）；荧光素酶基因；发光蛋白质基因。 按复制起点划分克隆载体： 质粒复制型—复制起点来自质粒或线粒体和叶绿体（有低拷贝和高拷贝） ARS复制型—染色体复制型（一般拷贝数比较高） 病毒复制型—复制起点来自病毒，若为RNA必须反转录为cDNA（高拷贝） 混合复制型：不同种生物复制起点混合（穿梭载体） 根据载体的分子生物学特性划分：质粒载体、病毒型载体、混合型载体 根据载体功能分类： 1）普通型载体：至少有一个以上的克隆位点和两个标记基因。如PBR322和pUC载体 2）表达型载体：3类：Ⅰ型：转录起始区（调控序列+启动子）+终止子；Ⅱ型：转录起始区+翻译起始区（核糖体结合序列和起始