夹层胶原“三明治”法冻存复苏肝细胞的实验研究百替生物.pdf

夹层胶原“三明治”法冻存复苏肝细胞的实验研究 1 2 1 殷海涛 滕皋军 刘宝瑞 1 南京大学医学院附属南京市鼓楼医院肿瘤科 南京 210008 2 东南大学医学院附属中大医院介入放射研究所 南京 210009 [摘要] 目的：研究胶原、表皮生长因子对新鲜分离及冻存复苏后Sprague-Dawley(SD)大鼠肝细胞活率、形态和功 能的影响，期望建立一种较为完善的肝细胞体外培养及冻存复苏体系，为肝细胞移植、生物人工肝及相关肝细胞研究 获取充足有效的肝细胞来源提供必须的技术支持和理论依据。方法：采用胶原酶二步原位循环肝脏灌注法分离 SD 大 鼠肝细胞，测定不同条件培养及冻存复苏后各组肝细胞的活性及功能。结果：双层胶原及双层胶原＋表皮生长因子组 细胞活率、蛋白质含量及细胞功能均优于普通组(P0.05)。结论：双层胶原体外培养体系更接近于肝细胞体内生长环境， 能有效的减少各种理化因素对肝细胞的损伤，有利于肝细胞在体外长期保存，是一种较为理想的培养及冻存复苏体系。 [关键词 肝细胞 胶原 表皮生长因子 分离培养 冻存复苏] 肝细胞移植术始于七十年代，八十年代开始国内外均有临床应用报告，但均未能证实 其临床有效性。九十年代以来，随着肝细胞冷藏复苏技术和分子生物学的突破性进展、移 植肝细胞标记技术的改进以及介入放射新技术在这一领域的应用，肝细胞移植再次成为新 [1] 的研究热点 。肝细胞移植术具有操作相对简单、对机体影响较小、可重复多次进行以及 一个供体可为多个受体使用，甚至有望建立肝细胞库等优点。迄今，有大量有关肝细胞移 植治疗急性肝功能衰竭的实验及临床应用报告，证实了移植的肝细胞在宿主器官生长繁殖 [2-4] 并产生明显的抗肝功能衰竭作用 。但肝细胞在体外增殖能力差，原代培养难以成功， 故在一定程度上限制了肝细胞移植的广泛开展。肝细胞移植，不但要求随时可获得充足有 效的高质量的肝细胞，而且需要植入体内的肝细胞能保持其形态特征、增殖分化和功能的 稳定性。因此，肝细胞移植要想广泛应用于临床并部分替代原位肝移植，必须建立一整套 完善的肝细胞分离制备、培养及保存技术。 本实验以SD 大鼠肝细胞为研究对象，通过改良Seglen 胶原酶原位灌注法分离制备高 产量、高活性的肝细胞，从细胞生存的基本条件出发，采用不同的培养及冻存复苏体系， 比较各组肝细胞在相同时间段各项功能的差异，并研究各种培养及冻存复苏体系对肝细胞 冻存复苏的影响，期望探索出一种较为理想的肝细胞培养及深低温贮存方法，为肝细胞移 植的深入发展提供合理、有效、充足的肝细胞来源。 1 1 11材料和方法 1.1实验动物、培养基、试剂和酶 1.1.1 SD 180 20 , 东南大学医学院动物实验中心提供的健康 大鼠，体重 ± 克雌雄随机，普 service@100 service@100 wwwwww..110000bbiiootteecchh..ccoomm sseerrvviiccee@@110000bbiiootteecchh..ccoomm 通清洁级。 1.1.2培养基：RPMI Medium1640培养基为GIBCO BRL 公司产品。 1.1.3 试剂和酶：D-Hank’s 液和Hank’s 液、PBS 及胶原均自行制备，Ⅳ型胶原酶购自 Worthington biochemical corporation 公司，小牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究 所，二甲亚砜(DMSO)购自上海生工生物工程有限公司，MTT 溶液为Fluka 公司产品，