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实验四 蛋白质印迹分析 【实验目的】 了解蛋白质印迹法的基本原理及其操作和应用。 【实验原理】 蛋白质印迹法又称为免疫印迹法，这是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术方 法。待测蛋白既可以是粗提物也可以经过一定的分离和纯化,另外这项技术的应用需要利用待测蛋白的 单克隆或多克隆抗体进行识别。 如图所示，可溶性抗原，也就是待测蛋白首先要根据其性质，如分子量，分子大小，电荷以及其 等电点等采用不同的电泳方法进行分离；通过电流将凝胶中的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上；利用 抗体（一抗）与抗原发生特异性结合的原理，以抗体作为探针钓取目的蛋白。值得注意的是在加入一 抗前应首先加入非特异性蛋白，如牛血清白蛋白对膜进行“封阻”而防止抗体与膜的非特异性结合。 经电泳分离后的蛋白往往需再利用电泳方法将蛋白质转移到固相载体上,我们把这个过程称为电 泳印迹。常用的两种电转移方法分别为: 1.半干法: 凝胶和固相载体被夹在用缓冲溶液浸湿的滤纸之间,通电时间为10 分钟~30 分钟。 2.湿法：凝胶和固相载体夹心浸放在转移缓冲溶液中，转移时间可从45 分钟延长到过夜进行。 由于湿法的使用弹性更大并且没有明显浪费更多的时间和原料，因此我们在这里只描述湿法的基 本操作过程。 对于目的蛋白的识别需要采用能够识别一抗的第二抗体。该抗体往往是购买的成品，已经被结合 或标记了特定的试剂，如辣根过氧化物酶。这种标记是利用辣根过氧化物酶所催化的一个比色反应， 该反应的产物有特定的颜色且固定在固相载体上，容易鉴别。因此可通过对二抗的识别而识别一抗， 进而判断出目标蛋白所在的位置。其他的识别系统包括碱性磷酸酶系统和125I 标记系统。 【实验材料】 1. 实验器材 SDS/PAGE 实验相关材料；电转移装置；供电设备；PVDF 膜（Millipore Immobion-P #IPVH 000 10）； Whatman 3MM 纸；其他工具：镊子、海绵垫、剪子、手套、小塑料或玻璃容器、浅盘。 2. 实验试剂 ⑴ 10x 转移缓冲溶液 （1L）：30.3g Trizma base(0.25M), 144 g 甘氨酸(1.92M),加蒸馏水至1L, 此时 pH 约为8.3，不必调整。 ⑵ 1x 转移缓冲溶液（2L ）：在1.4L 蒸馏水中加入400 ml 甲醇及200 ml10x 转移缓冲溶液。 ⑶ TBS 缓冲溶液:将 1.22g Tris (10 mM)和8.78g NaCl(150 mM)加入到1L 蒸馏水中，用HCl 调节 pH 至7.5 。 ⑷ TTBS buffer ：在1L TBS 缓冲溶液中加入0.5ml Tween 20 （0.05% ）。 ⑸ 一抗：兔抗待测蛋白抗体 （多克隆抗体）。 (6) 二抗：辣根过氧化物酶标记羊抗兔。 ⑺ 3% 封阻缓冲溶液（0.5L ）：牛血清白蛋白15mg 加入TBS 缓冲溶液并定容至0.5L，过滤，在 4°C 保存以防止细菌污染。 ⑻ 0.5%封阻缓冲溶液（0.5L ）：牛血清白蛋白2.5mg 加入TTBS 缓冲溶液并定容至0.5L，过滤，在 4°C 保存以防止细菌污染。 ⑼ 显影试剂：1ml 氯萘溶液 (30mg/ml 甲醇配置) ，加入10 ml 甲醇，加入TBS 缓冲溶液至50 ml， 加入30 ul 30% H O 。 2 2 ⑽ 染色液：1g 氨基黑18B (0.1%) ，250ml 异丙醇(25%)及100ml 乙酸(10%)用蒸馏水定容至1L。 ⑾ 脱色液：将350ml 异丙醇(35%)和20 ml 乙酸(2%)用蒸馏水定容至1L。 service@100 Detection 电 泳 膜转移 加入一抗 E E E E 封闭和清洗 加入二抗 底 物