第二章金堂黑山羊hnrnp k基因成熟肽编码区的克隆.doc

西南民族大学 硕 士 学 位 论 文 题 目 金堂黑山羊核内不均一核糖核蛋白Cloning and Semi-quantitative Analysis of hnRNP K Gene in Jintang Black Goat By FANG Hongbin A Thesis Submitted To Southwest University for Nationalities In Fulfillment of the Requirements For Master Degree Supervisor: Prof.Wang Yong College of Life Science and Technology Southwest University for Nationlities Chengdu,610041,P.R.China April 2010 特别说明 本论文由王永教授主持的四川省畜禽育种攻关项目 “大型黑山羊品系的培育”2007NG007-010)资助，是该项目的部分内容。 本论文在“西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室”完成。摘要 HnRNP K（heterogeneous nuclear ribonucleroprotein K）是hnRNP家族中的主要成员之一，也属于poly（C）结合蛋白的一种，是基因从转录到翻译以及mRNA前体剪接过程的主要蛋白质之一。关于山羊hnRNP K基因的克隆和功能结构的研究尚未报道。本实验分两段克隆了金堂黑山羊hnRNP K基因，并连接成一个完整的金堂黑山羊hnRNP K序列。在对金堂黑山羊hnRNP K进行了生物信息学分析的基础上，对hnRNP K在金堂黑山羊各个组织中的表达差异性进行研究，以期为了解金堂黑山羊hnRNP K基因功能结构特征及其生物学作用提供理论依据。 RT-PCRative analysis of hnRNP K 根据牛（NM_001034562）、人(NM_002140), 小家鼠 (NM_025279), Oryctoagus cuniculus (NM_001082125), 褐鼠(NM_057141)等序列设计了两对引物（P1和P2）。利用RT-PCR的方法，分段克隆得到的金堂黑山羊hnRNP K基因成熟肽编码区，引物P1所得的产物靠近5′端（720bp），引物P2所得的产物靠近3′端（1067bp），两段序列部分重叠；为得到金堂黑山羊hnRNP K的完整ORF区采用PCR重组技术，以分段克隆得到的两段基因为模板，成功地将两个基因片段连接成完整的金堂黑山羊hnRNP K cDNA序列。编码区长1326bp，编码441个氨基酸；GenBank 接受号GU457412，与已经刊登的物种的hnRNP K cDNA序列相比较，核酸序列的同源性达到94.5%～99.7%；氨基酸序列的同源性达98.9%～99.8%，并发现金堂黑山羊的hnRNP K的富C区结合区比其它物种缺少2个“RGG-box”。对哺乳动物的hnRNP K三级结构进行空间结构预测，结果表明存在AB两种类型，多胎动物为A型，单胎为B型，金堂黑山羊hnRNP K属于A型；对金堂黑山羊的hnRNP K在不同组织中的表达情况进行半定量分析研究表明，该基因在子宫、乳腺、卵巢、肾和肌肉均有表达，而且表达量存在差异；在心脏、垂体和下丘脑没有表达，说明了hnRNP K在金堂黑山羊各种组织中的表达存在差异。本研究为金堂黑山羊hnRNP K的结构和功能研究打下了良好的基础。 关键词：金堂黑山羊；hnRNP K；RT-PCR；克隆；生物信息学分析；半定量分析  Abstract HnRNP K（heterogeneous nuclear ribonucleroprotein K）is the chief member of the hnRNP family, and belongs to the poly(C) binding protein. It plays a very important role in the process of gene transcription，translation and pre-mRNA alternative splicing. The cloning of HnRNP K gene in Jintang Black Goat has not been reported. In this study, HnRNP K gene in