卡波氏肉瘤病毒k9基因重组慢病毒表达载体的构建及其编码蛋白功能 .pdf

第２６卷第６期 江 苏 大 学 学 报（医学 版） Ｖｏｌ．２６ Ｎｏ．６ 　 ２０１６年１１月 　 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＪｉａｎｇｓｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＭｅｄｉｃｉｎｅＥｄｉｔｉｏｎ） Ｎｏｖ．２０１６ 　 　 　 　 　 　 卡波氏肉瘤病毒 Ｋ９基因重组慢病毒表达 载体的构建及其编码蛋白功能初探 尚元翠，卢春，秦娣 （南京医科大学病原生物学系，江苏 南京２１１１６６） ［摘要］　目的：构建卡波氏肉瘤病毒（Ｋａｐｏｓｉ′ｓｓａｒｃｏｍａａｓｓｏｃｉａｔｅｄｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ，ＫＳＨＶ）Ｋ９基因的重组慢病毒载体，并探 究Ｋ９基因编码的病毒干扰素调节因子１（ｖｉｒａｌＩＦＮｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒ１，ｖＩＲＦ１）对人脐静脉血管内皮细胞（ＨＵＶＥＣｓ）增 殖的影响。方法：根据Ｋ９基因的核酸序列设计聚合酶链式反应（ＰＣＲ）的上下游引物。以实验室已有的真核表达载 体ｐＣＩＫ９Ｆｌａｇ为模板，ＰＣＲ扩增Ｋ９基因序列。ＰＣＲ产物经限制性内切酶双酶切后插入慢病毒载体ｐＨＡＧＥＣＭＶ ＭＣＳＩｚｓＧｒｅｅｎ（简称ｐＨＡＧＥ）中，构建重组慢病毒质粒ｐＨＡＧＥＫ９。将ｐＨＡＧＥＫ９质粒与包膜质粒ｐＭＤ２．Ｇ、包装质 粒ｐｓＰＡＸ２共同转染人胚肾上皮细胞（２９３Ｔ细胞），包装 Ｋ９基因的重组慢病毒。采用病毒梯度稀释法测定病毒滴 度。慢病毒感染ＨＵＶＥＣｓ后，观察绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）的表达，蛋白质印迹法检测ＨＵＶＥＣｓ中Ｋ９编码的ｖＩＲＦ１蛋白 的表达。采用流式分选技术获得稳定表达ｖＩＲＦ１蛋白的ＨＵＶＥＣｓ。运用细胞增殖实验检测ｖＩＲＦ１对ＨＵＶＥＣｓ增殖的 影响。结果：核酸序列测定结果表明，重组慢病毒质粒ｐＨＡＧＥＫ９构建成功。蛋白质印迹结果显示，Ｋ９基因重组慢 病毒感染ＨＵＶＥＣｓ后其编码蛋白成功表达。细胞增殖实验结果表明，稳定表达ｖＩＲＦ１的ＨＵＶＥＣｓ增殖能力显著强于 对照组。结论：ＫＳＨＶＫ９基因编码的ｖＩＲＦ１能够促进ＨＵＶＥＣｓ的增殖。 ［关键词］　卡波氏肉瘤病毒；Ｋ９基因；病毒干扰素调节因子１；慢病毒；人脐静脉血管内皮细胞；细胞增殖 ［中图分类号］　Ｒ３７３　　［文献标志码］　Ａ　　［文章编号］　１６７１－７７８３（２０１６）０６－０４６１－０５ ＤＯＩ： １０．１３３１２／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１７７８３．ｙ１６０２７３ ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｃａｒｒｙｉｎｇＫ９ ｏｆＫａｐｏｓｉ′ｓｓａｒｃｏｍａａｓｓｏｃｉａｔｅｄｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓａｎｄ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎｏｆＫ９ｅｎｃｏｄｅｄｐｒｏｔｅｉｎ ＳＨＡＮＧＹｕａｎｃｕｉ，ＬＵＣｈｕｎ，ＱＩＮＤｉ （ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＮａｎｊｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＮａｎｊｉｎｇＪｉａｎｇｓｕ２１１１６６，Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｃａｒｒｙｉｎｇＫ９ｇｅｎｅｏｆＫａｐｏｓｉ′ｓｓａｒｃｏｍａａｓ ｓｏｃｉａｔｅｄｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ（ＫＳＨＶ），ａｎｄｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＫ９ｅｎｃｏｄｅｄｐｒｏｔｅｉｎｖＩＲＦ１ｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆ ｈｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌｖｅｉｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ（ＨＵＶＥＣｓ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＫ９，ｆｏｒｗａｒｄ ａｎｄｒｅｖｅｒｓｅＰＣＲｐｒｉｍｅｒｓｗｉｔｈＸｈ