二、重组逆转录病毒载体法.ppt

基于性细胞的转基因动物制作人：马娟娟、周兴娜 主要内容 第一节、雄性生殖细胞的概况 对于基因转移研究来说，雄性生殖细胞很明显的优于雌性生殖细胞。研究雌性生殖细胞更加困难，胚胎形成后，从最初的几个阶段一直到减数分裂，生殖细胞的数量有限，减数分裂在受精时就已经结束了，而雄性细胞则不存在这样的问题。 一、精原干细胞的概念 精原干细胞（Spermatogonial stem cell，SSCs）是雄性动物体内唯一可以将遗传信息传递给后代的成体干细胞，其有自我更新和分化为精子的能力。利用精原干细胞可以诱导生成雄性生殖干细胞（mGSCs） 二、精原干细胞的概况 理论上讲一个精原干细胞携带有外源DNA ，可生 成多个阳性的子细胞，随着分裂还可生成更多 带有外源DNA 的精子，而这些精子与卵子结合后 即可产生转基因动物个体，这种放大效应是其他转 基因方法无法比拟的．因此，利用精原干细胞进行 转基因动物的制作成为目前各国在转基因研究领域 的热点之一 三、精原干细胞的发育过程 对于雄性哺乳动物而言，精原干细胞的形成经历了一个复杂的发育过程。当精子与卵子结合形成受精卵，受精卵经过卵裂发育成囊胚，再由囊胚发育为内胚层、中胚层和外胚层。生殖干细胞起源于外胚层，一些外胚层细胞从尿囊出发迁移到生殖脊，在此处发育为原始生殖细胞( PGCs) 。原始生殖细胞被支持细胞( Sertoli 细胞) 的前体细胞包围，形成精索( seminiferous cords) 。精索形成后，PGCs 随着形态的变化而发育成为性原细胞( gonocytes) ，性原细胞在动物出生后，逐渐发育为精原干细胞。 四、精原干细胞的分离与纯化 在小鼠睾丸内的全部生殖细胞中,仅有0. 03%是干细胞,因此对SSCs 进行分离和纯化是关键的一步。根据 SSCs 与曲细精管细胞悬液中体细胞( 支持细胞及少量的管周细胞)及其它各级分化的生精细胞在贴壁能力、 比重、 表面标志以及生长特性等方面的差异, 目前较常用SSCs 的纯化方法有以下几种。 1、差异贴壁法 2、免疫磁珠分离技术 3、流式细胞术分选 4、基于细胞形态的筛选 四、精原干细胞的分离与纯化 差异贴壁法 先将曲细精管细胞悬液接种在明胶处理的培养皿中,体细胞贴壁的速度远远超过 SSCs,大部分体细胞短时间即可贴壁,过夜培养后,体细胞大多完成贴壁,而SSCs 尚未贴壁, 或贴壁不牢, 轻轻吹打即脱落,将之吸到另一个培养皿可富集培养。研究证明,层粘连蛋白( laminin) 可被用来富集 SSCs, 层粘连蛋白是生精小管基底膜细胞外基质主要成分之一。曲细精管细胞悬液接种在层粘连蛋白处理过的培养皿中, SSCs首先贴壁,去掉未贴壁细胞,将贴壁细胞收集即可得到纯化的 SSCs。差异贴壁法是将以上两种差异贴壁的方法结合起来,先将得到的大鼠曲细精管单细胞悬液接种到 100 mm 培养皿中, 让大部分的体细胞完全贴壁, 将未贴壁细胞转移到胶原包被的培养皿中,让大部分分化的精原细胞贴壁, 再将未分化的细胞转移到层粘连蛋白包被的培养皿中, 贴壁的细胞大多数为未分化的精原细胞。 五、雄性生殖干细胞的获得 雄性生殖干细胞（mGSCs） 起源于原始生殖细胞( Primordial g ermcells, PGC) ,存在于新生和成年哺乳动物睾丸内,是精子发生的基础,能够进行自我更新并能分化为子代的精原细胞。 采用机械法和 2 步酶消化法分离出成年昆明小鼠的精原细胞, 经差速贴壁后,培养在小鼠胎儿成纤维细胞( MEF) 饲养层上, 2 周后得到类胚胎干细( ESCs)样 mGSCs。 五、雄性生殖干细胞的获得 mGSCs细胞生长图 五、雄性生殖干细胞的获得 支持细胞饲养层上生长 第二节、与传统转基因方法的比较 转基因技术自创立以来，各国学者一直在努力寻求技术上的改进，从而达到提高动物阳性率的目的。目前常用的转基因方法有以下几种: ①显微射法; ②逆转录病毒感染法; ③胚胎干细胞法; ④核移植法; ⑤精子载体法等。 一、显微注射法 一、显微注射法 一、显微注射法 一、显微注射法 二、重组逆转录病毒载体法 概念 逆转录病毒介导的转基因方法是借助逆转录病 毒DNA 载体与外源基因重组后经包装细胞系产生 缺陷型重组逆转录病毒,该病毒可以成功地感染靶 细胞,将外源基因整合于染色体基因组中而得到转 基因动物 二、重组逆转录病毒载体法 二、重组逆转录病毒载体法 二、重组逆转录病毒载体法 二、重组逆转录病毒载体法 三、电脉冲法 利用电穿孔仪可以将外源