生物质谱技术的发展一.ppt

串联质谱在蛋白质组学中的应用 测序其它方法 先用几种不同的蛋白水解酶对蛋白质进行酶解， 胰蛋白酶 胰凝乳蛋白酶 嗜热菌蛋白酶( thermo lysin) SV8 酶( staphylococcusaureusV8) 各种酶解片段用HPLC 等分离得到的纯肽或简单的混合肽， 可用MS/MS 测定其各组分的顺序，然后从不同蛋白水解酶酶解片段顺序，找到其重叠部分，即可得到整个蛋白质顺序。 蛋白质的翻译后修饰鉴定 磷酸化修饰 糖基化修饰 巯基和二硫键定位 氨基的乙酰化 泛素化修饰 磷酸化修饰 已知的磷酰氨基酸的类型有四种： 1．O-磷酸盐，通过羟氨酸的磷酸化形成的，如丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。 2．N-磷酸盐，通过精氨酸，赖氨酸或组氨酸中的氨基的磷酸化形成的。 3．乙酰磷酸盐，通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成的。 4．S-磷酸酯，通过半胱氨酸的磷酸化形成的。 磷酸化肽富集 分离技术有：双向磷酸多肽谱图(2D-PP)；高分辨率的凝胶电泳(2DE)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)。 对于32P标记的磷酸化肽或蛋白可用放射自显影或磷储屏检测，提取后可以高灵敏度MALDI-MS分析；如果32P标记不可行，就要用LC-MS/MS分析，常用HPLC与质谱联用。 常用的富集方法有：固定金属亲和色谱(IMAC) ；抗体免疫沉淀；化学修饰 。 质谱检测磷酸化肽和确定磷酸化位点的方法 ① MALDI-TOF-MS 可以通过肽指纹谱(PMF)鉴定蛋白质，与磷酸酯酶处理相结合可以确定磷酸化位点。 原理：磷酸酯酶处理后，磷酸化的肽丢失磷酸基团而产生特定质量数的变化，MALDI-TOF-MS通过检测这种质量数的变化而确定磷酸化位点。 质谱检测磷酸化肽和 确定磷酸化位点的方法 ②串联质谱(MS/MS) 进行前体离子扫描，这一方法是通过检测磷酸基团产生的特定片段来报告磷酸肽的存在。 原理：磷酸化肽经CID后会产生磷酸基团的特异性片段，这些特异性的片段在用串联质谱进行前体离子扫描时可作为磷酸肽的“报告离子”。 质谱检测磷酸化肽和 确定磷酸化位点的方法 串联质谱还可进行中性丢失扫描，这种方法是用MS/MS检测经CID后发生中性丢失H3PO4 (98 u)的肽段。 LC-MS/MS分析磷酸化位点 傅立叶变换质谱进行电子捕获解离 糖基化修饰 蛋白质糖基化可分为4类: N-糖基化 O-糖基化 C-甘露糖化 聚糖磷脂酰肌醇锚(GPI-anchor) 糖基化 糖蛋白 糖苷内切酶 还原、烷基化、蛋白酶解 MALDI-TOF-MS 糖含量 相对分子质量 ESI串联质谱 MALDI-TOF-MS 凝集素提取 氨基酸序列 糖基化位点 糖肽片段 糖蛋白结构分析示意图 糖基化位点确定 先用蛋白酶将糖蛋白酶解成含有和不含有糖链的肽片段，获得糖蛋白的肽质量指纹谱，再用糖苷内切酶将肽链切除，PMF发生变化，原含有糖肽段的质量由于糖链的丢失在质谱图上发生位移，通过网上数据库检索可以得到位移肽片段的氨基酸序列，而在这个序列中必含有糖基化位点，由此我们可以确定糖蛋白分子中的糖基化位点。 糖基化分析 用糖苷内切酶将糖链切除，将反应前后的质谱图进行比较，就能直接表述糖链的平均质量，而糖蛋白的平均含糖量可由糖链的平均质量占糖蛋白平均相对分子质量的百分比来表示。 应用ESI，对PMF中的肽片段进行分析，可以得到蛋白某中间片段的序列，对已知蛋白，依靠此序列，判断其归属，从而对糖蛋白的氨基酸序列加以证实。 不同的质谱方法可以产生多糖的源后裂解(PSD)和碰撞诱导解离 (CID)谱，这可以给出有关糖的序列，分支及糖间的连接等信息。 糖基化修饰 常用的糖蛋白质分离富集技术有:凝集素亲和技术、肼化学富集法、亲水相互作用色谱法、β消除麦克尔加成反应。 基于质谱的糖蛋白质鉴定及糖基化位点确定方法有:PNGase F 酶法、Endo H 酶法、β-消除麦克尔加成反应、三氟甲基磺酸法。 巯基和二硫键定位 原理：利用碘乙酰胺、4-乙烯吡啶、2-巯基苏糖醇等试剂对蛋白质进行烷基化和还原烷基化,结合蛋白酶切、肽谱技术,利用生物质谱的准确分子量测定,可实现对二硫键和自由巯基的快速定位与确定。这在含有多二硫键结构的活性多肽与蛋白质研究中有重要用途。 泛素化修饰 原理：由于泛素的C 末端是Arg-Gly-Gly 结构，经胰蛋白酶水解后，Gly-Gly 留在被修饰蛋白质的肽链上，使肽段质量增加114 ，起到质量标记泛素化位点的作用，进而通过串联质谱鉴