63 癌浸润を促进するタンパク质の构造研究 箱岛 敏雄 - 上原记念生命 .pdf

　上原記念生命科学財団研究報告集, 26 (2012) 63. 癌浸潤を促進するタンパク質の構造研究 箱嶋　敏雄 Key words：MT1-MMP，ERM，CD44，invasion， *奈良先端科学技術大学院大学 metastasis 情報科学研究科 情報生命科学専攻 構造生物学講座 緒　言 著者は，細胞内シグナル伝達を制御するタンパク質間相互作用を構造生物学の立場から研究してきた．特に，細胞骨格･接着 系を制御するRhoファミリーの低分子量Gタンパク質のシグナル伝達タンパク質群の構造解析で世界を先導する成果を上げて きた 1-12)．これらの研究は癌細胞の浸潤･転移と密接に関連しており，医学的な見地からも極めて重要であると考えている．実 際に，これまでに研究してきた細胞接着分子 CD44（ヒアルロン酸に結合して細胞を固定，あるいは増殖抑制）や，CD44 を アクチン細胞骨格へ結びつける ERM（Ezrin/Radixin/Moesin）タンパク質やその関連タンパク質 merlin（NF-2）は，浸 潤･転移の制御と深く関連することが理解されるようになってきた．そこで，これらの研究を発展させて，癌細胞の浸潤･転移に焦 点を当てた構造研究を提案した． 癌細胞の浸潤･転移の細胞生物学的基盤は，組織や細胞外マトリックス （ECM）からの剥離や溶解，ならびに細胞運動の活性 化である．後者においては，代表的 ECM であるヒアルロン酸に結合する CD44 が鍵となる．CD44 の接着機能には ERM タ ンパク質を介したアクチン細胞骨格との連結による足場形成が必須である．癌細胞の浸潤においては，細胞移動の先導端の CD44は，最終的には，自身の MT1-MMP (membrane type-1 matrix metalloproteinase) によって刈り取られることによ り ECM から剥離して，仮足の伸張や浸潤･細胞の移動が促進される．この時，MT1-MMP は細胞外ドメインのステム領域で CD44 と相互作用することが示されていた 13)．一方，MT1-MMP は ERM タンパク質との細胞内での直接の相互作用を通し て，ERM タンパク質に結合している CD44 へ効率的にリクルートされる新しい機構の存在が著者等の研究で示唆された 14)． 1）ERM タンパク質と MT1-MMP との複合体の三次元構造を決定して，MT1-MMP の細胞質ペプチドの認識機構を明らか にする，2）構造に基づいた相互作用解析により，ERM タンパク質を介した MT1-MMP の癌細胞先導端へのリクルートと CD44 との共局在･会合の新しい機構を検討する，3）MT1-MMPとERM タンパク質の特異的相互作用の構造レベルでの理解を手 がかりに，薬剤開発の糸口を探ることを目的として検討を行った． 方　法 これまでの予備的実験から，MT1-MMP を認識する ERM タンパク質 radixin のN-末端のFERM ドメイン，CD44 のの細胞 質領域（70 残基）の大腸菌でのタンパク質発現ならびに精製系は確立した．MT1-MMP の細胞質領域（20 残基）は比較 的に短いので化学合成した．先ず，BIAcore を用いて定量的な結合実験を行い，結合を確認した後に結晶化に移った．本研 究室の結晶化ロボット （現有HYDRA-II）を利用した微量 （0.3μl）結晶化に実績があり，5 mg のタンパク質試料で約 1,000 通りの結晶化条件の探索ができる．そこで，radixin の FERM ドメインと MT1-MMP の細胞質領域ペプチドを混合して，複 合体の結晶化条件を約 3,000 通り探索した．ここで得られた結晶を用いて，SPring-8 での放射光実験により X 線強度データ を収集した．回折実験では，結晶を抗凍結剤に浸した後に瞬間凍結させて X 線照射による損傷を抑えた．構造解析は，自前 のワークステーションや計算サーバ （SGI Onix）で迅速に推進した．既に構造決定していた radixin の FERM ドメイン構造 を用いて分子置換法で位相を決定した．ER