第四章常用分子生物学技术的原理及其应用 - 中南大学在线课程平台.doc

中南大学课科目: 授课内容: 授课对象：临床医学年制授课时数：学时授课：授课地点：授课时间： 第一版 生物化学，周爱儒主编，人民卫生出版社，2005，第6版 常用分子生物学技术的原理及应用 一、目的求： 掌握：Southern blot、 Northern blot及Western blot原理；PCR技术的原理。基因组DNA文库及cDNA文库构建；疾病相关基因的克隆方法；PCR技术的主要用途酵母双杂交技术的原理；基因芯片、蛋白质芯片的主要用途；DNA序列分析原理；遗传修饰动物模型的建立及应用Southern blot、 Northern blot及Western blot的原理；PCR技术的原理。疾病相关基因的克隆方法；酵母双杂交技术的原理；遗传修饰动物模型的建立。 多媒体教学多媒体课件多媒体 一、核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) : 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。 核酸分子杂交的原理 ： 带有某种标记的核酸单链作为探针，在一定条件下， 按碱基互补配对原则与互补的核酸单链退火形成双链杂交体， 鉴定靶序列的存在、分子大小或进行靶序列的相对定量分析。 （一）印迹技术 （二）探针技术 探针 (probe): 一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 探针的来源 二、印迹技术的类别及应用 （一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。 原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。 用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。 Southern Blot 操作步骤： DNA 琼脂糖电泳 印迹转移 预杂交 杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或显色 （二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。 原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。 用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。 操作过程： mRNA提取 甲醛变性电泳 印迹转移 预杂交 杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或化学发光 （三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 原理：将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。 其他 斑点印迹 (dot blotting) 将核酸变性后直接点样于膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量的研究------ 斑点印迹 原位杂交 (in situ hybridization) 标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸中的互补序列杂交, 进行定性、定位和相对定量分析。 DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip) DNA芯片: （Bio-chip、DNA arrays、Oligonucleotide microchip)。同时将大量探针固定于支持物上，一次性对样品大量序列进行检测和分析。特点：高度并行性，多样性，微型化和自动化。 优点：高通量、低消耗、自动化 将众多基因固定在芯片上，对不同个体、不同细胞周期、不同分化阶段、不同病变、不同刺激的肿瘤组织或细胞内进行检测，迅速将某些基因与肿瘤、功能联系起来。 DNA芯片技术的主要应用： ① 分析基因组、发现新基因 ② 基因表达的研