4 细胞培养温度.ppt

细胞培养 细胞培养是指从体内组织取出细胞在体外模拟体内环境下,使其生长繁殖,并维持其结构和功能的一种培养技术.细胞培养的培养物可以是单个细胞,也可以是细胞群. 细胞培养的基本条件 1.合适的细胞培养基 合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一,培养基不仅提供细胞营养 和促使细胞生长增殖的基础物质,而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。 2 优质血清 目前,大多数合成培养基都需要添加血清.血清是细胞培养液中最重要的成分之一,含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分. 3 无菌无毒细胞培养环境 无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件.在体外培养 的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力,一旦被微生物或有毒物质污染,或者自身代谢物质积累,可导致细胞中毒死亡.因此,在体外培养细胞时,必须保持细胞生存环境无菌无毒,及时清除细胞代谢产物. 4 细胞培养温度 维持培养细胞旺盛生长,必须有恒定而适宜的温度.不同种类的细胞对培养温度要求也不同.人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃,偏离这一温度范围,细胞的正常代谢会受到影响,甚至死亡.培养细胞对低温的耐受力较对高温强,温度上升不超过39℃时,细胞代谢与温度成正比;人体细胞在39-40℃1小时,即能受到一定损伤,但仍有可能恢复;在40-41℃1小时, 　　 细胞会普遍受到损伤,仅小半数有可能恢复;41-42℃1小时,细胞受到严重损伤,大部分细胞死亡,个别细胞仍有恢复可能;当温度在43℃以上1小时,细胞全部死亡.相反,温度不低于0℃时,对细胞代谢虽有影响,但并无伤害作用;把细胞放入25-35℃时,细胞仍能生存和生长,但速度减慢;放在4℃数小时后,再回到37℃培养,细胞仍能继续生长.细胞代谢随温度降低而减慢.当温度降至冰点以下时,细胞可因胞质结冰受损而死亡.但是,如果向培养液中加入一定量的冷冻保护剂(二甲亚砜或甘油),可在深低温下如-80℃或-196℃(液氮)长期保存。 5 合适的气体环境 气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有氧气和二氧化碳.氧气参与三羧酸循环,产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分.开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。 二氧化碳既是细胞代谢产物,也是细胞生长繁殖所需成分,它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值.大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4,偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响.但细胞耐酸性比耐碱性大一些,在偏酸环境中更利于细胞生长.但有一些细胞也喜欢偏碱环境中生长,如成纤维细胞最适合pH是7.4-7.6.每种细胞都有其最适pH值。 细胞生长与增殖 培养细胞的生存环境是培养瓶、器皿或其他容器，生存空间及营养是有限的。当细胞增殖到一定密度后，分离出一部分细胞和更新营养液，使细胞更好地生存，这一过程称之为 “传代” 值得注意的是：每次传代细胞在生长和增殖方面受到一定的影响 。 培养细胞一代生存期 　“ 一代”指细胞接种到分离再培养的所用的时间。与细胞倍增一代不是一个含义。在细胞一代中，细胞能倍增3～6次，经历三个阶段： 潜伏期，指数增生期和停滞期。 细胞类型 细胞类型根据是否附于支持物上生长的特性，分为: 贴附型 和悬浮型 。 1 贴附型 细胞贴附在支持物表面生长，只依赖贴附才能生长的细胞叫做贴附型细胞。例如L929,COLO205(半贴壁)。 2 悬浮型细胞 细胞不贴附在支持物生长，胞体圆形，在培养液中生长空间大，可长时间的生长。例如RAJI,RAMOS。 贴壁细胞传代操作技术 1 实验前, 将超净台用紫外灯照射30-60分钟灭菌, 关闭超净台的紫外灯，打开风机和照明灯。 2 用75%酒精无纺布擦拭双手、超净台、移液器、移液管、培养瓶、离心管并整齐摆放在超净台里面。 3 从CO2培养箱取出正在培养的细胞，用75%的酒精擦拭培养瓶的外表面，放入超净台。 4 把培养瓶里的培养液用移液器吸出弃掉；加入10mlD-PBS轻轻摇一下，在用移液器吸出，弃掉。 5 加1～2ml 0.25%的胰酶消化，消化约3～5分钟，再加5ml的培养基用移液器反复吹打，让细胞不再连成一片。 6 把细胞吸出来，放到离心管里面，800转离心5分钟，取出离心管，用75%的酒精擦拭培养瓶的外表面， 放入超净台，倒掉上清液，加入10ml新鲜培养液，用移液器反复吹打，让细胞分散开来，取样计数。 取出20ul细胞悬液，再加20ul台盘蓝，用移液器反复吹打，使均匀后，放到显微镜上数细胞，记录结果并计算。 7 根据细胞计数结果，将细