一种新型atpr依赖型clpp家族蛋白水解酶plclpp基因的克隆、表达和 .pdf

江苏农业科学　２０１６年第４４卷第５期 — ４７— 龚　丽，李云霞．一种新型ＡＴＰ－依赖型ＣｌｐＰ家族蛋白水解酶ＰｌｃｌｐＰ基因的克隆、表达和酶学特性［Ｊ］．江苏农业科学，２０１６，４４（５）：４７－５０． ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１６．０５．０１２ 一种新型ＡＴＰ－依赖型ＣｌｐＰ家族蛋白水解酶 ＰｌｃｌｐＰ基因的克隆、表达和酶学特性 龚　丽，李云霞 （上海海洋大学食品科学与技术学院／农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估重点实验室，上海２０１３０６） 　　摘要：运用基因克隆技术，以分离鉴定获得的蛋白水解酶高活性类芽孢杆菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｌａｕｔｕｓ）ＣＨＮ２６菌株的 基因组ＤＮＡ为模板，经克隆鉴定该菌株是一种新型ＡＴＰ－依赖型ＣｌｐＰ家族蛋白水解酶ＰｌｃｌｐＰ基因，全长５８５ｂｐ，编 码１９４个氨基酸，分子量约为２１ｋｕ。采用大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａｃｏｌｉ）ｐＥＴ表达系统构建ＰｌｃｌｐＰ基因表达质粒 ｐＥＴ－ ２８－ＰｌｃｌｐＰ，并在大肠杆菌 ＢＬ２１中实现了重组 ＰｌＣｌｐＰ蛋白的表达。利用组氨酸标签（Ｈｉｓ－ｔａｇ）亲和纯化法获得 ＰｌＣｌｐＰ纯化蛋白，发现ＰｌＣｌｐＰ可能与宿主菌未知伴侣分子形成蛋白复合物。ＰｌＣｌｐＰ复合物具有ＡＴＰ－依赖型酪蛋白 水解酶活性，最适反应温度为４０℃、ｐＨ值７．０。表面活性剂强烈抑制ＰｌＣｌｐＰ复合物的酶活性，而常规丝氨酸蛋白酶 抑制剂对其活性没有抑制作用。本研究结果为蛋白酶新基因资源的开发、ＣｌｐＰ家族蛋白酶的基础理论和应用研究奠 定了基础。 　　关键词：ＣｌｐＰ家族蛋白水解酶；类芽孢杆菌；基因；克隆；表达；酶学特性 　　中图分类号：Ｑ７８９　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１６）０５－００４７－０４ ［２］ 　　蛋白水解酶约占全球酶制剂市场的６０％，被广泛应用于 生物及真核生物中 ，其利用ＡＴＰ驱动蛋白底物解折叠并转 ［１］ ［３］ 食品、医药、洗涤剂、农业等领域 。微生物是水解酶的主要来 位进入蛋白水解腔（ｃｈａｍｂｅｒ）中降解成小分子肽 。１９８８ ［４］ 源，探索并开发微生物新基因资源，对于解决目前商品化酶制 年，ＣｌｐＰ蛋白酶首次被发现于大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａｃｏｌｉ）中 。 剂种类及来源较少、底物单一、价格昂贵等问题具有重要意义。 此后的大量研究表明，大肠杆菌中ＣｌｐＰ蛋白酶（ＥｃＣｌｐＰ）由蛋 ＣｌｐＰ（ｃａｓｅｉｎｏｌｙｔｉｃｐｅｐｔｉｄａｓｅ）家族ＡＴＰ－依赖型伴侣分子 白水解核心ＣｌｐＰ、依赖 ＡＴＰ的伴侣分子 ＣｌｐＡ或 ＣｌｐＸ组成， 相连（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ－ｌｉｎｋｅｄ）的酪蛋白水解肽酶广泛存在于原核 其蛋白水解腔由催化位点序列形成的２个反向同型七聚体环 ［２］ 构成 。在国外，ＣｌｐＰ蛋白酶已商品化，而目前国内尚无涉 收稿日期：２０１５－０４－０７ 及ＣｌｐＰ家族蛋白酶的研究报道。此外，有关类芽孢杆菌属 基金项目：上海市科学技术委员会项目（编号：０９３２０５０３６００）。 作者简介：龚　丽（１９８９—），女，上海人，硕士研究生，主要从事