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第十四周离子交换柱层析纯化 碱性磷酸酶及其检测 一、目的要求 1. 学习和掌握离子交换柱层析分离蛋白质的 原理和方法 2. 通过离子交换柱层析对碱性磷酸酶进行纯 化 3. 通过蛋白纯化系统对碱性磷酸酶进行纯化 4. 熟悉蛋白纯化系统操作 5. 通过SDS检测纯化效果 二、离子交换层析原理 不同蛋白质由于等电点不同，在同一pH介质 中所带的电荷种类数量不同，因而与离子交 换剂的结合能力不同。可以通过改变洗脱液 的酸碱度或盐浓度梯度，削弱其结合能力， 把结合的蛋白质分别洗脱下来，达到纯化的 目的。 等电点(PI) • 在某一PH的溶液中，氨基酸或蛋白质解离成阳离子和阴 离子的趋势或程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此 时溶液的pH成为该氨基酸或蛋白质的等电点。 • 等电点预测： 溶液pH值与蛋白质净电荷 当外界溶液的pH大于蛋 白质的pI值，蛋白质释放 质子带负电。当外界溶 液的pH小于蛋白质的pI 值，蛋白质质子化带正 电。 离子交换填料上也是带有电荷的 - + + + - •阴离子交换填料 - 阴离子带负电荷 + 阴离子交换剂是带正电荷的配基，结合带负电荷的分 子，替换样品溶液中的阴离子 - 最常见的配基有Q, DEAE, ANX + + - _ • 阳离子交换填料 + - 阳离子带正电荷 阳离子交换剂是带负电荷的配基，结合带正电荷的分 子，替换样品溶液中的阳离子 最常见的配基有S, SP, CM 强和弱的离子交换剂 强离子交换剂: 载量在很宽的pH 范围内保持恒定 Q Sepharose™ Fast Flow SP Sepharose Fast Flow strong anion strong cation exchanger exchanger DEAE Sepharose Fast Flow CM Sepharose Fast Flow