蛋白质谱技术 作者：蛋白化学组匡延松 生物有机体的生理活动、病理 .doc

蛋白质谱技术 作者：蛋白化学组　匡延松 ? 　　生物有机体的生理活动、病理活动以及药物的作用主要是通过蛋白质来实现的, 然而仅凭目前已知的蛋白质根本无法阐明各种复杂的生命活动过程, 因此, 以基因组的研究成果为基础, 以各种先进技术为支撑, 特别是生物质谱技术为依托，进一步研究生物有机体的全部蛋白质结构、功能及其相互作用已经成为必然。 ? 　　此报告主要介绍了质谱的发明与发展、生物质谱的结构及原理以及质谱鉴定蛋白应用和样品处理要求和一些实验经验。 ? 　　　　　　　 ? ? ?　　质谱具有诸多优点的同时其局限在于质谱进行的是破坏性分析，需要进行汽化，电离等步骤，故对样品而言是不可恢复的。另外，仪器昂贵、复杂，准入门槛较高。 ? 　　　　　　　 　　　　　　　 ? ? 　　最初的质谱仪主要用来测定元素或同位素的原子量，随着质谱技术不断发展改进，到20世纪50年代后期，广泛地应用于无机化合物和有机化合物的测定。80年代后期，质谱技术在生命科学领域的应用，更为质谱的发展注入了新的活力，形成了独特的生物质谱技术。 ? 　　　　　　　 ? ? 　　在质谱仪发明后相当长的时间里，质谱技术只用于小分子物质的测定，主要由于： 　　1、早期质谱的测定的质量范围有限； 　　2、电离方式太剧烈，不适合热不稳定、挥发性差的生物大分子物质。 　　3、生物大分子在解吸附和离子化过程中难以保持完整，形成的碎片太多且规律性不强…… ? 　　　　　　　 　　　　　　　 　　　　　　　 ? ? 　　气帘主要起雾化、蒸发溶剂以及阻止中性溶剂分子的作用。不挥发性的盐，进入质谱后会沉积，有强大的基质效应。 　　ESI 特点： 　　1.可生成带电的离子而不发生碎裂，可计算离子的真实分子量。 　　2.多肽离子带有多个电荷，在较小的m/z范围内可以检测大分子质量范围的分子。 　　3.由于采用液相方式进样，可与色谱等方法联用分离多肽混合物。 　　4.nanospray技术降低样品用量（1uL/h），提高检测灵敏度。 ? 　　　　　　　 ? ? 　　MALDI特点：首先，蛋白质样品是以固体形式点在靶体上的，具有操作简单、易控制、能容忍少量盐份、可以对靶体重复采样进行鉴定的优点； 其次，灵敏度高,被检测蛋白的量可低达fmol/L水平；另外MALDI-MS鉴定的整个过程能完全自动化，适合于蛋白质组的高通量分析。 ? 　　　　　　　 ? 　　　　　　　 ? ? ?　　质谱鉴定蛋白的基本原理是蛋白质经过酶切消化成肽段混合物，在质谱仪中肽段电离形成带电离子，质谱分析器的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（M/Z）的肽段离子分离开来，经过检测器分离的离子，确定每个离子的M/Z值。经过质量分析器可分析出每个肽段的M/Z，得到蛋白质所有肽段的M/Z图谱，即蛋白质的质谱峰图。通过和理论上蛋白质经过胰蛋白酶消化后产生的一级质谱峰图和二级质谱峰图进行比对而鉴定蛋白质。 ? 　　　　　　　 　　　　　　　 　　　　　　　 　　　　　　　 　　　　　　　 ? 　　质谱样品要求与处理经验： 　　样品要求：样品状态：液体、固体或胶内蛋白质（接受考马斯亮兰染色样品鉴定）；含盐量（液体和固体样品）：挥发性无机盐20 mM，不挥发性无机盐 5mM，请勿使用PBS、SDS和尿素等质谱干扰物质； 胶内蛋白质鉴定，蛋白质样品量不少于1mg/条带（考马斯亮兰染色）。样本用干冰或液氮寄送，应避免各类污染和反复冻融。 ? 　　LC-MS分析注意事项 　　1.源的选择： 　　ESI适合于中等极性到强极性的化物分子，特别是那些在溶液中能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的样品；MALDI适合于凝胶分离的样品。??? ???????? 　　2.正、负离子模式的选择正离子模式：适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。样品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式。负离子模式：适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。样品中含有较多的强伏电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式。 ? 　　3.流动相的选择 　　常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及一些易挥发盐的缓冲液，如甲酸铵、乙酸铵等，还可以加入易挥发酸碱如甲酸、乙酸和氨水等调节pH值。LC／MS接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲液，含钠和钾的成分必须＜lmmol/l。（盐分太高会抑制离子源的信号和堵塞喷雾针及污染仪器） ? 　　4.酶自降解峰与角蛋白的污染 　　酶自降解片段与角蛋白酶解片段的存在给质谱数据分析带来困难。 　　1)? 使用Trypsin-Gold 　　2)? 酶解时酶液使用不要过量 　　3)? 酶解时间不要过长 　　4)? 避免皮肤的直接接触（带手套、帽子） 　　5)? 洁净的操作环境 ? 　　5.蛋白质鉴定