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国境口岸产气荚膜梭菌毒素检测方法的编制说明 - 检验检疫标准管理
国境口岸蜱传新疆出血热病毒快速检测方法的编制说明
1 工作概述
1.1 任务来源
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。
本标准由国家质量监督检验检疫总局批准。
计划编号:2008B224类别:卫生检疫
标准名称:国境口岸蜱传新疆出血热病毒快速检测方法
负责起草单位:中华人民共和国广东出入境检验检疫局
1.2 制定标准的目的和意义
克里米亚-刚果出血热(Crimean Congo hemorrhagic fever, CCHF)1944年发现于俄国的克果米亚,克里米亚-刚果出血热病毒10%~50%。中国的CCHF 于1965 年首次诊断于南部新疆,后在北疆地区亦查出抗体,故称新疆出血热(XHF),该病每年在新疆发生区域性流行, 成为当地严重的公共卫生问题, 为我国已经发现的4 种虫媒病毒病之一。CCHF 病毒经蜱传播在蜱→非人类脊椎动物→蜱之间循环。人被带病毒蜱叮咬、接触感染动物内脏和皮毛、密切接触患者及其分泌物和排泄物等而感染本病。临床表现有急骤起病、寒战、高热、头痛、腰痛、口渴、呕吐,以消化道出血、鼻腔出血、皮肤黏膜出血点和出血斑为特征。CCHF 病毒可以由人传播给人, 境外的感染者或媒介昆虫通过国境口岸进入我国均可引起CCHF在我国的扩散,因此迫切需要建立CCHF快速检验鉴定方法。本项目的制定能够及时地掌握该病在国境口岸的发病情况,从而有效控制新疆出血热的突发疫情有效地控制该类传染病在国境口岸的传入和输出,保障广大人民群众的生命与健康,维护社会稳定和经济发展。1.3 国内外有关标准的简要说明
目前国内无相同的国家标准、行业标准或已立项未批准发布的检验检疫行业标准。本项目以出入境人员及跨境媒介昆虫为监测对象而制定,填补了新疆出血热国境乃至国内相关快速检测标准的空白,控制和预防该类传染病在国境口岸的传入和传出。2 研制过程
广东局技术中心卫生检疫实验室(BSL-3实验室)自200年月对该标准进行申报后,于200年月接到国家质检总局对该项行业标准下达的制订任务。本标准研制过程主要涉及以下几个阶段:
2.1 资料查阅与实验设计
为了全面了解国内外检验、研究的相关情况,本实验室相关工作人员从申报本标准之前就一直密切关注疫情动态及国内外研究进展,查阅了该领域大量的文献。从文献中寻找设计思路,特别是在检验方法上,设计和尝试了多种实验方案,并及时依据国内外报道调整和改进实验方案。其中,Garrison等(2007)和Yapar等(2005)引物和探针序列上稍加修改进行。
2.2 模板和引物的合成
的引物见表1,同时合成了DNA片断作为PCR扩增的模板。PCR扩增引物和包含DNA阳性模板的质粒由上海生工生物技术有限公司提供。表1 的引物序列(5’-3’) 扩增片断长度bp) XJ-FP ATDCRGGHACCATYAARTCTTGGGA 231 XJ-RP CKRATCATRTCWGAHARCATYTC CCReal FP1 TYTTTGCHGATGAYTCHTTYC 106 CCReal RP1 ACRGGGATKGTYCCRAAGCA CCReal Pr1 FAM- ACAGRATCTAYATGCAYCCTGC- BHQ1 CCReal FP2 RGAGTGGTGCAGGGAATTTG 57 CCReal RP2 CADGGYGGRTTGAAAGC CCReal Pr2 FAM- CAAAGGCAAGTACATCAT- MGB 2.3 免疫胶体金方法
使用自制的新疆出血热免疫胶体金试剂进行试验,阳性对照为原核表达的新疆出血热S基因片段编码的NP蛋白纯化产物。具体操作为:
2.3.1将被检样品、试剂及其它所用器材置于室温下平衡。
吸取80μ的被检样品于样品孔中。
10min后观察结果,最长不超过15min。检测区(T)检测区(T)结果见图1。
2.4 RT-PCR方法
Qiagen公司One step RT-PCR kit产品准备RT-PCR反应液,设50μ反应体系,每个待检标本反应液的组成为:5(RT-PCR buffer 10(l,10mM dNTP 2(l, 10mM XJ-FP 5(l,10mM XJ-P 5(l,RT-PCR Enzyme mix 2(l,双蒸水21(l,RNA模板5(l。同时设立阴性对照和阳性对照,阳性对照可为新疆出血热病毒核酸,也可为根据病毒核苷酸序列体外合成的RNA片段,阴性对照为不含新疆出血热病毒核酸的标本或无RNA酶的水。将PCR反应管置于PCR扩增仪上进行操作,RT-PCR反应程序为:50℃ 30min逆转录;95℃预变性15min;94℃变性1min,50℃ 1min,72℃ 1min,35个循环;72℃ 10min;4℃。扩增结束后,5(l扩增产物琼脂
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