一dna的提取方法简介.ppt

2. 制品的测定： 取2支试管，各加2ml待测液（内含DNA应在标准曲线的范围之内）和4ml二苯胺试剂，摇匀。其于操作同标准曲线的制作。 3.?根据测得的光吸收值，从标准曲线待测上查出相应该光吸收值DNA的含量，计算出制品中的百分含量。 数据: DNA纯度： 待测液中测得的核酸微克数 DNA%= X 100 待测液中制品的微克数 DNA产率: 测得的DNA的微克数 DNA%= X 100 原料的微克数 1.为什么在低温下进行？ 2.加柠檬酸钠和EDTA的作用 ? 3.加SDS的作用？ 4.加NaCL的作用，为什么要加到1mol/L? 5.加入异戊醇有什么作用？ 生物学基础实验教程. 滕利荣主编. 长春:吉林科学技术出版社, 1999.8, 573~578. 现代分子生物学实验手册. 张维铭主编. 北京: 科学出版社, 2003.6, 80~106. 精编分子生物学实验指南. 颜子颖、王海林译. 北京: 科学出版社, 1998.6, 30~40. 生物化学与分子生物学实验技术. 厉朝龙主编. 杭州: 浙江大学出版社, 2000.6, 107~116 分子克隆实验指南(第三版). 黄培堂等译.北京: 科学出版社, 2002.8,26~52. 生物化学与分子生物学实验教程. 梁宋平主编. 北京:高等教育出版社,2003.3,16~19. 生物化学实验(第三版). 陈钧辉, 陶力等编. 北京: 科学出版社, 2003.4,128~130. 生物化学实验指导. 余冰宾 主编. 北京:清华大学出版社, 2004.1, 158~160. 生物化学实验方法和技术. 陈毓荃 主编.北京: 科学出版社, 2002.8, 127~132 二、DNA提取技术 技术1：基因组总DNA的大量提取 本方法通过液氮研磨粉碎动植物组织、裂解液裂解细胞、有机溶剂抽提，使进入水相的核酸与蛋白成分分开，在RNA酶作用下，降解RNA，得纯度较高的DNA样品。 仪器：? 高速冷冻离心机、台式离心机、恒温水浴、低温冰箱或冰柜、冷冻真空干燥器、取液器、电泳仪、水平电泳槽、紫外分光光度计。 试剂 ： 细胞裂解液（100mM Tris-HCl 5mM EDTA 500mM NaCl 1% SDS pH 7.5）；饱和酚；氯仿/异戊醇；异丙醇；70%及无水乙醇；3M NaAC（pH5.2）；RNA酶；TAE缓冲液；载样缓冲液 操作： 动植物材料10g(鲜组织) 0.5g(干冻组织) 液氮，研碎 10ml裂解液(含1/10体积酚),(65℃预热) (加入等体积氯仿) (65℃，30min间隔5－10min轻摇一次 ) 离心(12000-15000rpm, 15min ) 上清液 (0.6体积冷异丙醇) (0.1体积3MpH5,2乙酸钠） 2mlTE(或水)＋10ulRNase，65℃,10-30分复溶和除RNA 挑取絮状体 （70%冷乙醇洗涤,真空干燥 ） （5000RPM，5min） 等体积酚/氯仿,氯仿抽提 （轻轻混匀、冰浴沉淀5min） 2倍无水乙醇、1/10体积醋酸钠 上清液 (10000RPM,10min ) (-80℃，30min ) (70％冷乙醇洗) 沉淀 基因组DNA干粉 (真空干燥) 保存： 干粉-20℃保存，或复溶于0.5-1mlTE或水中,分装成小体积, -20℃或4℃保存 注意: 裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解； 2. 各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解； 3. 取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰； 4. 异丙醇,乙醇，醋酸钠，醋酸钾等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀； 5. 本方法适用于以DNA片段的酶切分析、Southern印迹等中，具有快速、省时、省钱的特点。 技术2：细菌基因组DNA的微量提取法 本方法包括SDS裂解细胞，蛋白酶降解蛋白，CTAB去除多糖成分等内容。 仪器： 同技术1； 试剂： TE、TAE缓冲液；10%SDS；５ＭNaCL；20mg/ml蛋白酶Ｋ；CTAB/NaCL溶液(10% CTAB，0.7M NaCL? 4.1gNaCL 溶于80ml水中，缓