sirna 介导的foxa2 基因沉默对乙肝病毒复制的影响 - 现代仪器与医疗.pdf

检验检测 2016年  第22卷   第2期 siRNA介导的FOXA2基因沉默对乙肝病毒 复制的影响 1 2 2 张岩明 　戎秀格 　李广平 （1.唐山市传染病医院检验科，河北唐山　063000 ；2.唐山市工人医院检验科，河北唐山　 063000 ） [ 摘　要 ]　目的 ：探讨小干扰RNA （small interfering RNA，siRNA ）介导的FOXA2 基因沉默对乙肝 病毒（HBV ）复制的影响。方法：设计靶向FOXA2 基因siRNA 序列，构建质粒转染HuH-7 人肝癌细胞。 用QT-PCR 和 RT-PCR 检测细胞FOXA2 基因mRNA 变化；用Western blot 检测细胞FOXA2 蛋白变化； 用Northern blot 分析FOXA2 基因沉默后HBV RNA 表达。结果 ：构建FOXA2 基因稳定沉默的F-S 细 胞株，FOXA2 基因与蛋白沉降效率明显。FOXA2 基因沉默后，HBV 病毒3.5kbRNA 升高，FOXA2 抑制HBV 病毒的复制。结论 ：FOXA2 基因通过降低3.5kbRNA 的表达抑制乙肝病毒的复制。 [ 关键词 ]　siRNA ；FOXA2 ；乙肝病毒 中图分类号：R575.1　文献标识码：A　文章编号：2095-5200(2016)02-052-03 DOI：10.11876/mimt201602019 乙肝病毒（HBV ）引起的传染性疾病。HBV 是 Scientific company ）。 双链环形结构[1] ，3.5kbRNA 包含C （核抗原）/P （DNA 多聚酶）/S （表面抗原）/X （X 蛋白），是HBV 进 2　方法 行复制的关键因子。FOXA [2-3] 是核转录因子，由 2.1　细胞培养 FOXA1 、FOXA2 、FOXA3 构成。FOXA 是肝转录因 HuH-7 细胞用含10%胎牛血清的DMEM 培养基， 子之一，在肝器官的形成和发展及肝进行新陈代谢 在37 ℃、5% CO2 条件下孵育箱内培养。EDTA 胰酶 过程中发挥重要作用。FOXA 也是HBV 复制的关键 消化HuH-7 细胞，取对数生长期细胞实验。 调控点，因为HBV 病毒所有的启动子和增强子均包 2.2　细胞转染及筛选 5 HuH-7 细胞接种于6 孔板中，37 ℃、 含FOXA 结合位点。大量实验表明HBV 转基因鼠中 将 1.5 ×10 转入FOXA2 ，HBV 复制降低，进而推断FOXA2 可 5% CO2 孵育箱中过夜。待HuH-7 细胞贴壁覆盖率 以抑制HBV 的复制。因此我们设计靶向FOXA2 的 70%~80% 时，换新培养液，将含FOXA2-siRNA 的 siRNA 序列，构建质粒转染人肝癌细胞HuH-7 ，观 质粒与jetPRIME 转染试剂按 1:2 混合滴加到6 孔 察FOXA2 基因沉默后对乙肝病毒复制的影响。 板 1、2 、3 孔细胞上。同时将不含靶序列空质粒与 jetPRIME 转染试剂按照同样比例滴加到6 孔板4 、5 1　材料 孔细胞上。第6 孔为阴性对照只加培养液（阴性组）。 质粒载体（上海吉凯基因公司）；jetPRIME 转染3 周后挑取单克隆进行鉴定。将FOXA2 基因沉 Transfection Reagent （Polyplus ) ；Trizol （Invitrogen ）； 默细胞株命名为F-S 细胞株；空质粒细胞株命名为 核酸提取试剂盒（庄盟国际生物基因公司）；Maxima K-S 细胞株。提取F-S 细胞株、K-S