应用说明测量内源性蛋白质荧光的模块化光谱工具.pdf

测量内源性蛋白质荧光的模块化光谱工具 作者：Yvette Mattley，博士 内源性荧光是一个指示蛋白质结构和功能的有效指标。荧光的强弱可以让 研究者洞悉蛋白质在不同生理学条件（温度、pH和离子浓度）下的构象状 态与活动。 应用说明 关键词 • 蛋白质 • 蛋白质折叠 前言 • 氨基酸 • UV LED 荧光的测量需要稳定可靠的激发光源。 发光二级光（LED）是个实惠的选择，利 用现有的高功率 UV LED 可得到有关蛋白质和氨基酸的宝贵信息。 技术 • 荧光 • 模块化光谱 • 吸光度 应用 • 蛋白测定 • 内源性荧光检测 为此目的，我们使用了 280 nm UV LED 和背照式 CCD 阵列光谱仪来检测不同构象 状态的溶菌酶和牛血清白蛋白（BSA）样品。 溶菌酶是天然存在的酶，常作为细 菌药物；BSA 是对体内生化功能有重要作用的蛋白质。 结果限制了模块化光谱法 具有监测蛋白荧光的能力，组件的灵活性有利于用户针对生物分子和需要 UV 激 发来产生荧光的非生物样品来进行设置。 背景 大部分蛋白质含在紫外线激发下能产生荧光的芳香族氨基 酸。 样品的荧光光谱取决于氨基酸的组成和蛋白质的构象 状态。 当蛋白质从天然状态（折叠）变为变性状态（展开） 时，氨基酸周围的环境也变化了，影响了氨基酸的荧光性质。 内源性荧光的变化可用于监测蛋白质的展开。 这对某些应 用（诸如医疗诊断）而言是十分宝贵的信息，因为研究者正 在研究神经退行性疾病和其他疾病引起的蛋白质展开。 可通过多种方法改变蛋白质的天然状态，包括升高温度、离 散剂或其他化学试剂（诸如尿素和盐酸胍）、调节 pH 值。 随 着蛋白质展开，之前在蛋白疏水核中的氨基酸外露出来。溶 解暴露以及由此导致的对猝灭剂的敏感性使得色氨酸 图 1：血浆主要成分牛血清白蛋白的荧光光谱解释了接触于低pH （Trp）、络氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）的荧光减弱。 缓冲溶液后蛋白质结构的变化。 用去离子水制备 5 mg/ml L-色氨酸溶液（T90204 用 280 nm UV LED 配合高灵敏度光谱仪使用，来检测溶菌酶 Aldrich），用于吸光度测量，以判定Trp 的最佳激 和 BSA 样品的荧光。 为了说明蛋白质构象的影响，检测了 发波长，提供 Trp 荧光的参考值。 对荧光和吸光度 用磷酸缓冲生理盐水（1×PBS pH7.4）和0.1 M HCl/KCl 稀 进行测量。 释的蛋白质的荧光光谱（pH 1）。 结果 Trp 是产生内源性蛋白质荧光光谱的主要因素，芳 香族氨基酸的量子产率最高。 Trp 的最大光吸收出 现 280 nm 处，是由吲哚环产生的。 用 280 nmLED 激发的荧光光谱在 350 nm 处出现波峰。 Tyr 的吸 收光谱与 Trp 类似，最佳激发波长在 274 nm 左右。