annexin a4-egfp 融合蛋白的表达纯化及其凋亡检测能力 - 药学学报.pdf

904 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 20 17, 52 (6): 904 910 Annexin A4-EGFP 融合蛋白的表达纯化及其凋亡检测能力初探 1 1 1, 2* 婧 , 王 杰 , 华子春 (1. 南京大学生命科学学院, 江苏 南京 2 10023; 2. 江苏省产业技术研究院医药生物技术研究所, 江苏 南京 2 10023) 摘要: 膜联蛋白 (annexin) 是一类进化保守的多基因家族蛋白, 可与细胞膜磷脂酰丝氨酸 (phosphatidyl- serine, PS) 结合, 由于PS 与许多重要疾病密切相关, 具有作为药物发现新靶点的潜力, 使得 annexin 具有良好 的药物发现价值和新药研发前景。Annexin A4 ( 以下称A4) 是膜联蛋白家族成员之一, 参与多项细胞功能, 如胞 吐作 和凝血反应, 所有这些功能与膜联蛋白可结合酸性磷脂的能力相关。目前对A4 的功能尚不完全了解, 获 得足量的A4 是深入了解A4 的结构与功能的基础。为了克服传统从生物组织中提纯人源 A4 的方法得率不高, 且较为复杂等问题, 本文通过原核系统重组表达A4, 以获取大量可溶性蛋白, 探究其与PS 的结合能力, 为后续 研究奠定基础。利 分子生物学的手段构建融合表达质粒 pET28a-annexin A4-EGFP, 大量表达、选用并比较了 两种获取可溶性annexin A4-EGFP ( 以下称A4-EGFP) 融合蛋白的纯化方法, 同时检测A4-EGFP 对凋亡细胞的识 别能力。通过亲和层析纯化获得纯度为 80% 的 A4-EGFP; 而选 膜吸附纯化方式, 最终获得了纯度达 90% 的 蛋白。 式细胞仪检测结果显示: A4-EGFP 融合蛋白可识别和标记早期凋亡细胞, 其与PS 亲和力为79.58 ± 11.68 nmol ·L 1, 与A5-EGFP 和PS 的亲和力同处一个数量级。本文成功实现了A4-EGFP 在原核体系中的高效可溶性 表达, 建立了简易、高效的分离纯化方法, 获得了产率高达75.2 mg ·L 1 的A4-EGFP, 为深入研究A4 的功能及其 潜在的应用奠定了基础。 关键词: 膜联蛋白A4; 原核表达; 纯化; 凋亡检测; 序列比对 中图分类号: R966 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (20 17) 06-0904-07 Expression, purification of annexin A4-EGFP fusion protein and preliminary study on its apoptosis detection ability 1 1 1, 2* LIU Jing , WANG