2011年生物医学与药物疗法）p21是非小细胞肺癌对吉非替尼治疗敏感 .doc

P21（waf1/cip1）是非小细胞肺癌对吉非替尼治疗敏感的必要因素 Yi-Fan Zhaoa,1, Chong-Ren Wanga,1, Yan-Ming Wua, Sheng-Lin Ma（马胜林）b, Yuan Ji（纪元）c,**, Yan-Jun Lu（陆琰君）a,* a 同济大学医学院肿瘤研究所 b 浙江省肿瘤医院 c 复旦大学附属中山医院病理科 * 通讯作者。电话：+86 2165 983 260；传真：+86 2165 983 793；Email地址：yanjunlu@ ** 通讯作者。电话：86 2164 041 990 2732；Email地址：newera_ji@ 1 共同第一作者 本研究由中国国家重点基础研究发展计划（973项目）（编号2009CB521703）和同济大学医学院扬帆计划项目（2010YF04）资助 摘要 肺癌是目前全世界癌症的首要死因。吉非替尼作为一种选择性表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂，被广泛用于非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗。本研究表明吉非替尼可以降低磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）水平，同时升高p21水平、抑制周期蛋白依赖性蛋白激酶2/4（cdk2/4）和细胞周期蛋白E/D1（cyclinE/D1）活性，造成G1期阻滞，从而阻断NSCLC细胞细胞周期进程，抑制细胞生长。吉非替尼通过诱导的p21蛋白稳定性，而不是增加RNA蓄积使p21水平升高。此外，本研究发现从姜黄科温郁金中提取的天然药物β-榄香烯能够通过调节细胞中p21的水平从而恢复耐药细胞对吉非替尼的敏感性。以上结果表明吉非替尼与β-榄香烯联用可能能够更好的治疗对吉非替尼耐药的NSCLC。p21对于NSCLC细胞对吉非替尼治疗敏感的必要性也在p21过度表达和敲除的研究中得到进一步的证实。基于以上结果，我们认为p21是NSCLC细胞对吉非替尼治疗敏感的必要因素。 关键词：非小细胞肺癌，?p21，周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDKs），吉非替尼，β-榄香烯 1. 引言 吉非替尼是一种小分子喹唑啉衍生物，是表皮生长因子受体（EGFR）的酪氨酸激酶抑制剂（TKI）。EGFR能够促进细胞生长，作为致癌基因在80~90%的非小细胞肺癌（NSCLC）中表达[1]。但目前已知仅有部分NSCLC患者（12~18%）能够从吉非替尼治疗中获益[2]。吉非替尼已在近期被批准作为有EGFR激活变异的NSCLC患者的一线治疗用药。此项决策是基于IPASS研究三期临床的数据结果，该研究显示在亚洲一线治疗中，使用吉非替尼治疗的患者在无进展生存期、客观缓解率、改善耐受和生存质量方面的收益都优于卡铂/紫杉醇双联化疗方案[3-5]。经吉非替尼治疗的患者在EGFR基因的变异和扩增以及其它标志物如磷酸化蛋白激酶B（p-akt）和ErbB-3的表达方面也表现出更好的结果[6-8]。然而，目前NSCLC与吉非替尼敏感性相关的分子机制仍不清楚。此外，此类预测因子与临床收益之前的关系也急待得到明确。 在另一方面，即使是在对吉非替尼敏感的病例中，持续给药后也会发生吉非替尼耐药的情况。临床上急需针对于吉非替尼治疗后复发的NSCLC患者的辅助治疗手段。β-榄香烯是一种提取自姜黄科温郁金的天然植物药，被用于治疗包括NSCLC在内的多种肿瘤，该药通过抑制Ras/Mapk信号通路及细胞周期起到抗癌作用[9,10]。β-榄香烯与细胞毒类药物联用时对多种肿瘤具有协同抗肿瘤作用，且有观察表明在治疗耐药的患者时也表现出相同的协同效果，表明该药很可能具有抗耐药的作用。 对细胞周期调控的改变是肺癌的普遍特征。P21作为WAF1/CIP1/SDI1基因的产物，是周期蛋白依赖性蛋白激酶的抑制因子，可经由p53依赖性或非依赖性通路激活[11]。研究表明p21在细胞周期调节中起到重要作用，特别是在G1期阻滞[12,13]。近期的研究进一步揭示出p21在吉非替尼的抗增生作用中起到了关键性作用[14-17]。然而，p21的表达与吉非替尼对NSCLC的治疗作用之间的关系仍未明确。 本研究对p21表达量与吉非替尼的抑制细胞生长作用、增殖活性、以及p53在不同细胞株中的状态的相关性进行了评估。结果表明p21是NSCLC对吉非替尼治疗敏感的重要因素。 2. 材料与方法 2.1. 通过荧光活化细胞分类计（FACS）进行细胞周期分析 细胞用PBS洗涤两次，经胰蛋白酶消化后，重新悬浮于含有0.1％ Triton X-100和RNA酶（1mg/ml）的PBS中（Sigma）。细胞悬浮液在37℃下温育30分钟。加入碘化丙啶（分子探针）使终浓度为50ug/ml，4℃下放置1小时。将细胞进行过滤，使用流式细胞仪及FACScan系统（Becton Dickinson）对细胞周期进行分析。 2.2. 细胞和转染 在含有10％胎