快速高分离度液相色谱鄄质谱联用方法筛选tau 蛋白激酶2 抑制剂.pdf

Vol.34 高等 学校 化 学 学报 No.5 2013年5月 摇 摇 摇 摇 摇 摇 CHEMICALJOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES摇 摇 摇 摇 摇 摇 1111~1114 doi:10.7503/ cjc 摇 摇 快速高分离度液相色谱鄄质谱联用方法筛选 Tau 蛋白激酶2 抑制剂 1,2 3 3 1,3 陈摇 宁 ,孙摇 一 ,越摇 皓 ,刘淑莹 (1. 中国科学院长春应用化学研究所,长春质谱中心,长春 130022; 2. 中国科学院大学,北京100049; 3. 长春中医药大学,吉林省人参科学研究院,长春 130117) 摘要摇 建立了测定Tau 蛋白激酶2(Tau protein kinase 2,TPK2)催化反应产物磷酸化十肽(PKpTPKKAKKL) 的快速高分离度液相色谱鄄质谱方法(RRLC/ MS)用于筛选TPK2抑制剂. 反应溶液总体积为50 滋L,将终浓 度为20 nmol/ L 的TPK2与终浓度为5 滋mol/ L 的底物十肽(PKTPKKAKKL)于30 益反应30 min,用等体积乙 腈终止反应并加入终浓度为1滋mol/ L 的磷酸化十肽(PKpTPKKAKKV)作为内标,采用AgilentSB鄄C 色谱柱, 18 以乙腈鄄水为流动相梯度洗脱分离后,用RRLC/ MS进行定性及定量分析. 该方法可通过精确定量一定时间 内的酶促反应产物来反映酶活性被抑制的程度,作为TPK2抑制剂的筛选方法,本方法具有简单、灵敏、快 速的优点,能够避免光谱法筛选可能产生的假阳性结果,可用于TPK2 的先导化合物的高通量筛选. 关键词摇 阿尔兹海默病;Tau蛋白激酶;快速高分离度液相色谱鄄质谱 中图分类号摇 O657摇 摇 摇 摇 文献标志码摇 A摇 摇 摇 摇 阿尔兹海默病(Alzheimer爷s diease)是一种神经退行性疾病,其病理学特征主要有老年斑(Senile plaque)和神经元纤维缠结(Neurofibillary tangle). 神经元纤维缠结由过度磷酸化的Tau蛋白聚集而成. Tau蛋白激酶2(Tau protein kinase2,TPK2)在Tau蛋白的过度磷酸化进程中发挥着重要作用[1~4] ,所 以筛选Tau蛋白激酶2 的抑制剂对开发阿尔兹海默病新药具有重要意义. [5] 目前,以激酶为药物靶点的研究越来越多,约占据药物开发项目的30% . 用于筛选TPK2抑制 剂的方法主要有化学萤光法(Chemiluminescent assay)和放射法等[6~8]. 上述2种方法均需标记物,极 大地增加了筛选成本[1,6~8] ,因而开发一种非标记的、非放射性的方法来筛选TPK2抑制剂具有重要的 意义. 质谱具有高精确度、灵敏度和快速等特点,能够直接检测反应物或产物而不受干扰,还可以同 时检测和定量多种组分,近年来在药物筛选中得到广泛应用[9~16]. 本文采用快速高分离度液相色谱鄄质谱联用(RRLC/ MS)方法对TPK2 的反应产物磷酸化十肽进行 定量检测,考察了待筛选化合物对TPK2 的抑制作用,提供了一种简单、快速、灵敏的液相色谱鄄质谱 检测方法. 1摇 实验部分 1.1摇 试剂与仪器 Tau蛋白激酶2(TPK2)、氯化镁、二硫苏糖醇(DTT)和三磷酸腺苷(ATP)均购自Sigma公司;三氢 甲基氨基甲烷(Tris)购自Promega公司;多肽(PKTPKKAKKL和PKpTPKK