病毒的实验诊断.ppt

病毒检验的一般原则 快速、简便、特异和敏感。 首先根据流行病学和临床特点，初步 判断可能感染的病毒。 病毒检验的内容（三个方面） 测病毒体和宿主细胞的病理改变 直接查病毒和分离培养 检测病毒蛋白抗原和核酸 血清学试验，检测机体产生的抗体 第一节 标本采集与运送 一、标本的采集 1.采样时间 尽可能在发病的初期，急性 期或患者人院的当天进行。 2.标本种类的选择 根据临床感染的症状 及流行病学资料，判断可能感染病毒种类，选择相应部位采取标本。 常见分离病毒标本的选择 3．标本的采集方法 (1)血液：以无菌取抗凝血10ml。 抗凝选用100 u／ml肝素钠。 用于分离CMV、HSV，、黄病 毒、EBV、HIV-1及新生儿肠 道病毒。 (2)脑脊液：以无菌取脑脊液1～2ml， 冰浴立即送检。在4℃可存放72h。 用于分离柯萨奇病毒、ECHO病毒、 肠道病毒、腮腺炎病毒。 (3)宫颈或阴道拭子：采取病灶部位分 泌物，或将拭子伸人宫颈约lcm停留 5秒取出，冰浴立即送检。用于分离 HSV、CMV。 (4)粪便标本：取2～4ｇ粪便加10ml运送 液立即送检，用于分离腺病毒、肠道 病毒和轮状病毒。 (5)含漱液：用无菌生理盐水让患者含漱 。用于分离流感病毒、副流感病毒、 鼻病毒、RSV等。 (6)喉拭子：用压舌板避免唾液污染，用拭子 采取咽喉部表面。用于分离腺病毒、CMV、 肠道病毒、HSV、流感病毒等。 (7)尿道拭子及尿液标本：尿道拭子伸人尿道 4cm转动3次，以获得较多的上皮细胞，用 于分离CMV和HSV。 (8)尸检标本：死亡后尽早采集各种器官，分 别使用器械和容器。 病毒抵抗力弱，室温中容易灭活， 用于分离培养的标本要尽快送检， 4℃下数ｈ或-70℃。 冻存液中加入甘油或二甲基亚砜 (DMSO)等作保护。 病毒运送培养基以Hanks液为基础加 灭活的小牛血清。为抑制细菌生长加 青霉素100U／ml和链霉素100μg／ml， 为了抑制真菌的生长加入2．5μg／ml 二性霉素B或40μg／ml制霉菌素。 组织细胞培养 鸡胚培养 动物接种 1.组织细胞培养 根据细胞的来源、特性和传代次数分为： (1)原代细胞培养：将离体的新鲜组织器官经机械或胰蛋白酶处理，制成单个细胞悬液，加营养液在细胞培养皿中培养。活细胞贴壁生长形成的单层细胞，称之为原代细胞。 原代细胞再用胰蛋白酶或EDTA等消化后加营养液继续培养，称次代细胞。 (2)二倍体细胞株：仍保持二倍体特性。 寿命一般为40～50代，如人胚肺细胞 广泛用于病毒分离和疫苗制备。 (3)传代细胞系：来于肿瘤细胞，染色体 特征类似肿瘤细胞。常用的有人宫颈 癌细胞(Hela)、人喉上皮癌细胞 (Hep-2)。繁殖快，易于传代保存。只能用于病毒病毒分离，不能用于疫苗制备。 常用于病毒分离的细胞 正常细胞 鸡胚是用于分离粘病毒科、疱疹病毒、痘类病毒的较为理想的材料。 优点 有不同部位可以接种，易于病毒繁殖；来源充足，操作简便；通常是无菌的；对接种病毒不产生抗体。 缺点 卵黄中含有抗家禽病原的抗体；可带有某些病毒如鸡白血病病毒；饲料中的抗生素也能传递给鸡胚。 卵黄囊接种 羊膜腔接种 尿囊腔接种 绒毛尿囊膜接种 脑内接种 胚体接种 常用动物 动物十分重要。小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、猴等常用于分离病毒。 接种部位 静脉、鼻咽腔、腹腔、脑内、皮内、皮下等。 发病情况观察 食欲、活动及粪便情况；局部和全身变化 神经系统感染可出现震颤、松毛，软弱、不安、弓背、抽死亡；呼吸系统病毒可出现咳嗽、呼吸加快、少食等。 不死，解剖后查病毒抗原，死亡，取病变组织传代和鉴定。 三、病毒的鉴定 1.根据临床特点，流行病学资料，标 本来源，大致了解病毒的一些特 性，有助于确认病毒的种类。 2.动物感染范围及特点 病毒感染动 物的范围、发病的潜伏期。 3.细胞培养特点。综合上述资料作出 鉴定。 病毒鉴定的方法 1.细胞培养的结果观察 病毒增殖后导致细胞发生: ①细胞病变效应(CPE)： 细胞肿大，变圆堆积成葡萄状，细胞溶解出现空斑，细胞融合形成多核巨细胞，胞 浆内或核出现嗜酸性或嗜碱性包涵体等； ②不出现细胞病变现象。 ③细胞培养液pH的变化。 2.中和试验 原理 病毒加上特异性抗