多酚氧化酶的活性在青枯雷尔氏菌中的表达 摘要：青枯雷尔氏菌的基因 .doc

多酚氧化酶的活性在青枯雷尔氏菌中的表达 摘要：青枯雷尔氏菌的基因序列表明，几个特定的基因编码多酚氧化酶。为了研究这些基因的实际表达，我们发现在微生物细胞提取物中各种多酚氧化酶活性，包括漆酶、甲酚酶、儿茶酚氧化酶活性。多酚氧化酶生化实验条件从石碳酸培养基、PH和十二烷基硫酸钠该基因编码的酶明确自杀质粒插入突变一代无效基因突变RSp1530是一个漆酶蛋白活性。其他两个基因RSc0337和RSc1501，铜蛋白 。RSc0337产具有很强的酪氨酸羟化酶活性，已经表明，这种酶参与黑色素合成。RSc1501是一种倾向于氧化酶获得突变体初步抗酚类化合物突变体L -酪氨酸比野生型菌株出较高的灵敏度。这些结果表明在致病过程，酚类化合物可能参与植物机制。多酚氧化酶（ PPOs ）是一组铜酶能够催化氧化芳香族化合物的氧（32）多酚氧化酶EC 1.10.3.2）和酪氨酸酶（(EC 1.14.18.1）。酪氨酸酶催化两种反应：羟基化（），如L-酪氨酸羟基化转变为L-多巴。并且氧化L-多巴和其它氧化型二元酚形成醌（二酚酶活性 EC1.10.3.1）。漆酶氧化主要是对和虽然基因组测序表明(1, 6)。漆酶的活第一次在脂固氮螺菌最近，漆酶的活其他微生物被描述，(23)和大肠杆菌 (14)。细菌首与黑色素合成（16）苜蓿中华根瘤菌 (25) (19)的褐化有关。至少在链霉菌和的基因存在一个同第二基因参与铜转移到细菌是第一次发现表达两种不同的原核生物PPOs其中是酪氨酸酶明确参与黑色素合成，活体外十二烷基硫酸钠（ SDS ）激多酚氧化酶是一种膜结合酶生理作用仍不确（30 34）。在本报，共存的和漆酶在其他一些属得证。(3, 11)和根瘤菌（5）中得到证明，其酪氨酸酶活性先前已被描述（16，25）。但是可能底物特异性密切相关没有数据。在一些微生物，特别是在真菌，黑色素的合成和酶的活已涉及发病（2）。对于植物细菌病原体，一个简单的有哪些信誉好的足球投注网站发现不同基因编码PPOs。此外，许多微生物称为微生物，实际上表达酶活的与植物细菌，如产脂固氮螺菌苜蓿中华根瘤菌和海洋真菌Microbulbifer degradans (17, 33)。 植物使用不同的途径来抵御病原体。最强大的防御系统是植物过敏性反应。 这是一个非常协调一致的反应，包括细胞死亡（细胞程序性死亡）积累高水平的酚类化合物加固细胞壁（35）。此外，产生多种多样的次生代谢产物参与了抵抗微生物病原体。虽然化合物是植物，一些化学成分，如苯丙衍生物，经常参与这些保护程序（10）。与植物相互作用细菌存在编码PPOs基因在病原微生物特别微生物感染力促使我们研究这些是否真的微生物。我们选择了青枯一个适的模式，因为这病原菌引起萎蔫和死亡，如土豆和西红柿，其基因组已经测序（29）。 菌株，质粒，用于此项研究的该细菌菌株质粒引物列青枯菌通常是生长在生理盐水中（BSM）50 mM钠钾磷缓冲液（pH 7.0）含有15(NH4)2SO4、 0.8 mM MgCl2、2 uM FeSO4、0.2 mM CaCl2、8 uM Na2MoO4、 5 uM MnCl2， 0.5 ％甘油和0.01 ％酵母提取物。用另一实验中，其中（每升） 10克蛋白胨1克酪蛋白水解物，以及5克葡萄糖。大肠杆菌通常生长在培养基。必要时，50 g/ml. 浓度卡那霉素氨苄西林利福平。 青枯菌突变体的酶活受到影响几个多酚氧化酶基因突变株同源重组产生。首先， RSc1501基因的PCR扩增使用适当的正向和反向引物（分别 F1501和R1501）（表1）。野生型青枯菌菌株的基因组DNA用来作为模板。 25个循环的PCR95 ° C下 1分钟， 58 ° C下1分钟，并扩展为72 ° C的2.25分钟进行。该反应混合1.5uM氯化镁， 0.2三磷酸，每个引物0.7，模板DNA 100，EcoTaq聚合酶（Ecogen）。正如预期的PCR产物是1.6 kB长含有完整的RSc1501基因扩增。该产是BamHI切割获得两个铜结合位点酶切片段DNA连接酶连接到pBlueScript KSII（）。混合物到大肠杆菌DH5，被选定为氨苄西林耐药性。获得的质粒（pBRI15）EcoRI和 SacI降解，内部RSc1501基因片段亚克隆在pFSVK质粒。由此产生的质粒（pCN1501）转化大肠杆菌S17 - 1（PIR），被选定为卡那霉素。在此之后，该质粒自发Rifr青枯菌的R3。简言之，琼脂表面上。 40的成倍增长发表面。该培养36小时，然后收集刮细胞。适当稀释利福平和卡那霉素（50克/毫升）以大肠杆菌。 pFSVCN包括R6K的复制起源，它需要Pir蛋白，因此它不表达这种蛋白细菌是自杀的，如青枯菌。唯一可能的途径获取是通过RSc1501基因此质粒基因同源重组。为了确认有RSc1501基因断，利用P