vero细胞流感病毒的大规模培养和纯化 - 生物通.pdf

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（１１）：２０～２４ Ｖｅｒｏ细胞流感病毒的大规模培养和纯化  何春艳 　陈　则　吴书军　唐丽丽　秦　洁 （上海生物制品研究所　上海２０００５２） 摘要　目的：采用反应器技术以细胞为基质培养流感病毒，并探索其纯化工艺。方法：采用５Ｌ反 应器无血清条件下以Ｖｅｒｏ细胞为基质培养流感病毒，病毒收获后，经灭活、澄清，采用阴离子柱去 除宿主ＤＮＡ，亲和柱浓缩流感病毒，最后采用分子筛三步层析法进行纯化。结果：整个纯化工艺 ＨＡ回收率达 １０２％，蛋白降低率为 ９５．３％，宿主蛋白降低率为 ９９．７７％，ＤＮＡ的降低率为 ９９．９９％。结论：成功建立了一种细胞流感病毒的纯化工艺。 关键词　Ｖｅｒｏ细胞　流感病毒　纯化 中图分类号　Ｑ８１３．１ 　　目前生产鸡胚流感疫苗所采用的密度梯度离心法 １．２　Ｖｅｒｏ细胞无血清细胞库 分离纯化病毒的工艺，不适用于Ｖｅｒｏ传代细胞培养生 　　Ｖｅｒｏ细胞从美国组织菌种收藏中心（ＡＴＣＣ）引进， 产流感疫苗的生产，因为不能有效去除杂蛋白和核酸， 以无血清ＸＸ培养基传代ＸＸ代适应建立的Ｖｅｒｏ细胞 而Ｖｅｒｏ传代细胞可能的致瘤性，人用疫苗对传代细胞 无血清主细胞库和工作细胞库，经检测无外源因子污 的残余蛋白和基因组 ＤＮＡ设定了严格的要求。因此 ［１］ 染，无致瘤性，符合生物制品生产用细胞株要求 。 这种传统的密度梯度离心方法由于不能有效去除宿主 １．３　流感病毒毒种 细胞 ＤＮＡ，并不适合于用传代细胞培养的病毒纯化。 　　鸡胚尿囊液Ａ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）由本 本文采用层析技术，探索一套适合于Ｖｅｒｏ细胞培养流 所生物技术中心提供。 感疫苗的纯化工艺。 １．４　细胞培养和病毒培养 １　材料与方法 　　复苏工作库细胞，用无血清培养液培养，经过３～５ 代传代扩增，接种５Ｌ反应器，以微载体Ｃｙｔｏｄｅｘ３进行 １．１　材　料 培养。培养３～４天，待微载体满球率达到７０％以上， 　　无血清培养基 ＶＰＳＦＭ 购 自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｈｉｔｒａｐ 以不同ＭＯＩ值接种流感病毒鸡胚尿囊液，同时添加猪 ＤＥＡＥＦＦ５ｍｌ预装柱、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦＦ和微载体Ｃｙｔｏｄｅｘ３ 胰酶，使胰酶终浓度为５ｇ／ｍｌ，于３４℃培养继续３～４ μ 购自ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＡｍｅｒｓｈａｍ，ＣｅｌｌｕｆｉｎｅＳｕｌｆａｔｅ购自日 天，直至细胞基本从微载体上脱落，收获病毒，并以１／ 本Ｃｈｉｓｓｏ公司。流感病毒毒种、标准抗原及标准抗血 ５０００（ｖ／ｖ）加入福尔马林，于４℃灭活７天，并取样进行 清均购自英国ＮＩＢＳＣ。猪胰酶购自Ｓｉｇｍａ公司。随机 灭活验证。培养流程：细胞培养传代（３７℃，１０～１４ｄ） 引物地高辛标记和检测试剂盒（ＤＩＧＨｉｇｈＰｒｉｍｅＤＮＡ ５Ｌ反应器中细胞培养（３７℃，４～５ｄ） 病毒接种和 → → ｌａｂｅｌｉｎｇａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎ