蛋白印迹技术(western blotting).pdf

Western Blotting 全攻略 蛋白免疫印迹（Western blotting 或 Immunoblotting ）一般由凝胶电泳、样品的印迹和 免疫学检测三个部分组成。第一步是做 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质 按分子量大小在凝胶中分成带。第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物 上，用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC 膜)和 PVDF 膜，蛋白转移的方法多用电泳转移（转 移电泳），它又有半干法和湿法之分，现在大多用湿法。第三步是用特异性的抗体检测出已 经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测的方法可以是直接的和间接的。现在多用间 接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体杂交结合后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶 （AP ）或辣根过氧化物酶（HRP ）标记的抗第一抗体的抗体）杂交结合，再加酶的底物显 色或者通过膜上的颜色或 X 光底片上暴光的条带来显示抗原的存在。该技术被广泛应用于 蛋白表达水平的检测中。 一、 基本原理 第一部分：SDS电泳 1、蛋白中含有很多的氨基(+)和羧基(-)，不同的蛋白在不同的PH值下表现出不同的电荷， 为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，我们在上样前，通常会进行一些处理(上样 缓冲液)。即在样品中加入含有SDS 和β-巯基乙醇的上缓冲液。SDS 即十二烷基磺酸钠 （CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+），是一种阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的 氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构； β-巯基乙醇是强还原剂，它可以断开半胱氨酸 残基之间的二硫键。电泳样品加入样品处理液后，经过高温处理，其目的是将SDS 与蛋白质 充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构同时使整个蛋白带上负电荷；另外 样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于监控整个电泳过程；另外样品处理液中还加入适 量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。当样品上 样并接通两极间电流后(电泳槽的上方为负极，下方为正极)，在凝胶中形成移动界面并带动 凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物向正极推进。样品首先通过高度多孔性的浓缩胶，使样 品中所含SDS 多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。 2、电泳启动时，蛋白样品处于PH6.8 的上层，PH8.8 的分离胶层在下层，上槽为负极，下 ¯ ¯ 槽为正极。出现了PH不连续和胶孔径大小不连续：启动时Cl 解离度大，Pro 解离度居中， ¯ ¯ ¯ ¯ 甘aaCOO 解离度小，迁移顺序为（PH6.8 ）Cl Pro —COO 。在Cl¯与Pro¯之间和Pro¯与— COO¯之间都将出现低离子区，同时也出现高电势，高电势迫使Pro¯ 向Cl¯迁移，—COO¯ 向 Pro¯迁移。如：一个Cl¯领路，—COO¯推动，蛋白在中间，这样就起到浓缩的作用了。在浓 缩胶运动中，由于胶联度小，孔径大，Pro¯受阻小，因此不同的蛋白质就浓缩到分离胶之上 成层，起浓缩效应，使全部蛋白质处于同一起跑线上。当蛋白质进入分离胶时，此时Pro¯ ， Cl¯，甘aa离子在PH8.8 的溶液中，Cl¯完全电离而很快到达正极，甘aa 电离度加大很快跃过 蛋白质，而到达正极，只有蛋白质分子在分离胶中较为缓慢的移动。由于Pro¯在电泳过程中， 受到溶液离子的变化而PH值发生变化，但每一瞬间，其所带电荷数除以单位质量是不同的， 所以带负电荷多者迁移快，反之则慢，这就现了电荷效应。由于胶孔径小，而且成为一个整 体的筛状结构，它们对大分子阻力大，小分子阻力小，起着分子筛效应，也就是蛋白质在分 离胶中，以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异，最终达到彼此分开。 3、PAGE 胶的聚合原理：甲叉双丙烯酰胺和丙烯酰胺在过硫酸胺的作用下聚合，形成胶， 如下图： CH2=CH —CH2—CH—[CH2—CH]x— ︳ ︳ ︳ C=O CH2