实验三 碱性磷酸酶的分离纯化和km测定.ppt

第二部分 碱性磷酸酶Km测定 一、实验目的 掌握碱性磷酸酶的的动力学鉴定—Km鉴定 二、实验原理 当温度、pH 及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度随作用物浓度[S]增 大而增大，但增大到一定限度时，作用物浓度再增加，则反应速度不再增加。此 时反应速度为最大速度（Vmax）。Michaelis Menten 对酶促反应速度与作用物浓 度之间的这种关系进行了大量实验研究，并于 1913 年提出了数学方程式，即著名的米一曼方程式： 作图后，将各点连线延长，直线与横轴的交点为 1/Km，根据在横轴上的截 距，可以计算出该酶的 Km。本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷 酸苯二钠产生酚和磷酸，酚在碱性溶液中与 4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧 化生成红色的醌衍生物，根据红色深浅可测出酶活力高低。其反应式如下： 磷酸苯二钠 磷酸盐 + 酚 AKP 酚 + 4-氨基安替比林 红色醌类衍生物 铁氰化钾 PH 10 碱性 利用在不同作用物浓度的条件下，测定的酶活性（A），按 Lieweaver-Burk 二氏法作图，从 x 轴上的截距求得其 Km 值。 三、实验仪器及试剂 仪器： 恒温水浴锅，721 型分光光度计。 试剂：1. 0.04mol/L 作用物液：称取 10.16g 磷酸苯二钠（C6H5PO4Na2·2H2O），用 煮沸后冷却的蒸溜水溶解， 并稀释至 1,000ml， 4ml 氯仿防腐， 加 贮于棕色瓶内， 置冰箱内保存，可用一周。2. 0.1mol 碳酸盐缓冲液（pH10.0）： 称取无水碳酸钠 6.36g 及碳酸氢钠 3.36g，溶解于蒸馏水中，并稀释至 1,000ml. 3. 碱性磷酸酶液：用自己提取的碱性磷酸酶液，用 pH10 缓冲液稀释 5-7 倍。 0.5mol/L NaOH 溶液 0.3%4-氨基安替比林：称取 3g4 氨基安替比林及碳酸氢钠 42g，用蒸馏水 溶解，并稀释至 1,000ml，贮于棕色瓶中，放冰箱内保存。 0.5%铁氰化钾：称取 10g 铁氰化钾及 30g 硼酸各溶于 800ml 蒸馏水中，溶 解后两液混合加水至 2,000ml。置棕色瓶中，放冰箱内保存。 四、操作步骤 1、取大试管 7 支，按下表操作： 加入酶液，混匀之后立即计时，各管在 37℃水浴中准确保温 15 分钟后，立 即加入 0.5Mol NaOH 液 1.0ml 以终止反应。 2、 显色：各管中加入 0.3%4 氨基安替比林 1.0ml 和 0.5%铁氰化钾 2.0ml，充分混 匀，放置 10 分钟，以 0 管为对照，在波长 510nm 下比色，记录各管的吸光度。 3、作图：所测各管的吸光度代表各管中反应速度 V，以之为纵轴，以作用物浓度 [S]为横轴，在坐标纸上连接各点作图，观察曲线的形状。 以各管吸光度值的倒数 为纵坐标，以作用物浓度的倒数 为横坐标，作图并求此 酶的 Km 值。 五、实验结果 （1）说说碱性磷酸酶提取过程中的注意事项 （2）计算碱性磷酸酶的Km值 单选题： 1．下面关于酶的描述，哪一项不正确：A ??? A、所有的酶都是蛋白质????? B、酶是生物催化剂????? C、酶具有专一性 ??? D、酶是在细胞内合成的，但也可以在细胞外发挥催化功能 2．一个简单的米氏酶催化反应，当[S]Km时：B ??? A、反应速度最大??????????????????? B、底物浓度与反应速度成正比 ??? C、增加酶浓度，反应速度显著变大 ???D、[S]浓度增加，Km值也随之变大 3．酶的比活力是指：B ??? A、任何纯酶的活力与其粗酶的活力比??? B、每毫克蛋白的酶活力单位数 ??? C、每毫升反应混合液的活力单位 ??? D、以某种酶的活力作为1来表示其他酶的相对活力 是非题： 1．如果有一个合适的酶存在，达到过渡态所需的活化能就减少。√ 2．T.Cech从自我剪切的RNA中发现了有催化活性的RNA,称之为核酶。√ 3．酶促反应中，酶饱和现象是普遍存在的。√ 第二部分 碱性磷酸酶Km测定 * 目的:掌握碱性磷酸酶的的动力学鉴定—Km鉴定 * 实验原理：当温度、pH 及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度随作用物浓度[S]增 大而增大，但增大到一定限度时，作用物浓度再增加，则反应速度不再增加。此 时反应速度为最大速度（Vmax）。Michaelis Menten 对酶促反应速度与作用物浓 度之间的这种关系进行了大量实验研究，并于 1913 年提出了数学方程式，即著名的米一曼方程式： * 林-贝氏作图法 本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷 酸苯二钠产生酚和磷酸，酚在碱性溶液中与 4-氨基安