mf130-m5 ptopo- entrd 5分钟定向gateway入门克隆构建试剂盒 .doc

M5 pTOPO- ENTR/D定向Gateway 入门克隆构建试剂盒使用说明书 产品名称 单位 货号 M5 pTOPO- ENTR/D定向Gateway Kit 20T MF130-01 M5 pTOPO- ENTR/D定向Gateway Kit 4x20T MF130-04 【储存条件】 长期保存，请置于-20?C，有效期12个月。 【产品简介】 本制品采用了Directional Topoisomerase Cloning（定向拓扑异构酶克隆技术）可以在5分钟内将待表达目的基因（高保真酶扩增的平末端片段）一步法定向克隆到Gateway入门载体（entry vector），得到的入门克隆（entry clone）可以和各种Gateway目的载体（destination vector）通过LR重组反应，生成表达克隆（expression clone）。方便目的基因在原核/哺乳动物细胞/酵母/昆虫表达系统切换表达。超过90%插入为正确方向插入，减少克隆筛选耗费的时间。本载体不含原核表达Shine-Dalgarno（SD)序列，因此构建原核表达克隆时应选择带SD序列的目的载体进行LR重组。也可在设计的时候，在目的片段前自带SD序列。测序可以采用 M13F/M13R通用引物测序（见后面图谱）。 【产品组分】 组分名称 20 T 4x20 T pTOPO-ENTR/D Vector(30ng/μl) 20 μl 80 μl 10× Enhancer 20 μl 80 μl 【引物设计】 1. 为了达到定向克隆的目的，上游引物5’端应该加上额外的4个碱基CACC，这样PCR产物的5’端可以和载体上突出的GTGG互补配对，从而达到定向克隆的目的。 举例： 待表达序列：5′-ATG GGA TCT GAT AAA ... 设计上游引物：5′-CACC ATG GGA TCT GAT AAA ... 2. 如果不计划和载体C端融合表达，则下游引物的起始端应该加上终止密码子（密码子序列应该为反向互补序列，例如终止密码子是TGA，那么下游引物起始为TCA）。 3. 如计划和载体C端融合表达，则下游引物的起始端应该不包含终止密码子；为达到定向克隆的目的，下游引物5’起始应该不包含CACC，这样可以避免PCR产物的3’端也可以和载体上突出的GTGG互补配对而造成错误方向的插入。 【连接反应】 1. 连接前准备： PCR引物不能磷酸化。使用扩增产物是平末端的高保真聚合酶系列扩增（如X5超保真酶或mix，聚合美货号MF003/MF004）。PCR产物建议胶回收纯化（货号：聚合美MF031)。 2. 室温（20?C -30?C）按照如下体系操作（10μl体系）： 纯化后的PCR产物 0.5-8μl pTOPO-ENTR/D Vector 1μl 10x Enhancer 1μl ddH2O Xμl 总体积 10μl 加完试剂后，用移液器轻轻吹打混匀或者轻弹管底混匀，低速瞬时离心收集所有液体在离心管底。 注意此步骤不能在冰上进行，只能在室温（20℃-30℃）进行。 不同大小插入片段的推荐用量： 插入片段大小（bp） 最佳用量（ng） 100-1000 20-40 1000-2000 30-70 2000-5000 40-100 3. 室温（20℃-30℃）连接5分钟。本载体推荐室温5分钟完成连接，但在很多情况下连接2-3分钟已经可以得到足够多的转化子。 4. 连接产物可直接转化克隆感受态细胞（如DH5a，TOP10等）或贮存于-20℃。如尚未准备好感受态细胞，可以将连接产物短时间置于冰上备用。 【转化及菌落PCR检测】 1．50-100μl感受态细胞，置于室温解冻，完全解冻后（约1分钟左右）轻掸几次将细胞均匀悬浮。 2．加入5μl连接液(最多可全部加入，只要体积不超过感受态细胞体积的1/10)，轻轻混匀，室温放置5分钟。 根据经验，本公司载体使用商品化的感受态细胞不需要冰浴和热休克、室温放置5分钟便可获得足够多转化子，如果实验室自制感受态细胞或者效率较低时，可以按照标准程序进行。 3．加300-500μl LB或者SOC培养基(不含抗生素)，37℃ 180 rpm振荡培养60分钟。 根据经验，一般可以直接将培养基（事先平衡至室温） 加入感受态细胞的1.5 ml 离心管，盖上离心管盖，水平固定在振荡培养箱