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2013-09-02 承担单位：福建省农科院农业生物资源研究所 试验设计： 试验项目：Native分析Cry2Ab蛋白寡聚化 试验人员：许炼 试验负责：朱育菁、潘志针 报告日期：2013-09-02 计数月份：2013年月 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设计，实施实验，记载，分析清晰，结论清晰文献完整，发表水平 福建省农业科学院农业生物资源研究所 农业微生物研究中心 电话: 0591 传真: 0591试验目的 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native)是在不加SDS疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。 一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。酸性蛋白通常在非 变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离酸性蛋白。 试验方法 活化的Cry2Ab蛋白。 APS(电泳级)、TEMED（电泳级）购自泰京生物技术有限公司；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺 PowerPac垂直电泳仪（BIORAD），Centrifuge 5418R（Eppendorf）。 18.17g Tirs碱，溶于80mL去离子水中，加入约3mL浓盐酸调节H值至8.8，定容至100mL4℃贮存。 12.1g Tirs碱，溶于80mL去离子水中，加入约7mL浓盐酸调节H值至6.8，定容至100mL4℃贮存。 ，定容至100mL4℃贮存。 ，定容至100mL4℃贮存。 30Acr-Bis（W/V） 丙稀酰胺29g，N-N-甲叉双丙稀酰胺g，加入去离子水定容至100mL，值7.0，棕色玻璃瓶中4℃贮存。g过硫酸铵，溶于10mL去离子水中，分装至200μl，-20℃储存，放置4℃可用一周左右。 10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液 (SDS free) Tris碱 30.5 g Glycine(电泳级) g 去离子水定容到1L，使用时稀释倍使用考马斯亮蓝R-250 1.0 g 甲醇 500 mL 冰醋酸 100 mL 去离子水 400 mL 脱色液 甲醇 500 mL 冰醋酸 100 mL 去离子水 400 mL 2.3 实验方法 2.3.1 Native PAGE胶配制 1、酸性ative PAGE 浓缩胶 去离子水 1.9mL 30%Acr-Bis 1.7mL 1.5mol/L Tris-Hcl，PH 8.8 1.3mL 10%SDS 50μL 10%AP 50μL TEMED 3μL Total 5mL 分离胶（10%） 去离子水 1.4mL 30%Acr-Bis