实验12 sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳.ppt

实验12 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 －细菌蛋白质的分离 一、目的要求 1、学习电泳原理和技术 2、学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板 电泳分离蛋白质技术 二、实验原理 电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。 电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。 电泳技术从20世纪40年代得到广泛应用。近年来各种类型的电泳技术发展十分迅速。比较常用的有：醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 二、实验原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和 交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide，简 称Bis)在加速剂N，N，N?，N?—四甲基乙二胺(N，N，N?，N?- tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸 铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素 (ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维 网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝 胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。 二、实验原理 PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。 材料：细菌培养物 试剂：30%丙烯酰胺1mL；1.5mol/L Tris(PH8.8)； 1.0mol/L Tris(PH6.8)；10%SDS；10%过硫酸铵； TEMED；2×SDS凝胶加样缓冲液； pH8.3 Tris- Gly电极缓冲液；1%琼脂糖溶液； 0.05％考马斯亮兰R250 仪器：超净工作台；离心机；移液器；大培养皿； 垂直电泳槽；稳压稳流电泳仪 ；脱色摇床 三、实验材料、试剂与仪器 图.1 夹心垂直板电泳槽示意图 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽7.冷凝系统 图.2 凝胶模示意图1.样品槽模板 2.长玻璃板3.短玻璃板 4.凹形橡胶框 四、学生观看实验录像 下面请同学们先观看录像，注意SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白的基本原理和基本操作，仔细观察预备液及电泳缓冲液的配制、制胶、灌胶、加样、电泳及染色等重要操作步骤。 1、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）的原理 ：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS测定蛋白质分子量。 五、该实验的一些重点问题和难点 十二烷基磺酸钠(SDS)在可以结合大量的蛋白质分子（1克蛋白结合1.4克SDS），这种带有相同密度的负电荷的SDS-蛋白质复合物，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，子团块，从而掩盖了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异；由于蛋白质结合SDS后，蛋白质的构象发生了改变，SDS-蛋白质在水溶液中近似长椭圆状，不同复合物短轴一样约为18埃，而长轴随蛋白质分子量成正比变化。因此在进行电泳时，蛋白质的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS测定蛋白质分子量。 五、该实验的一些重点问题和难点 五、该实验的一些重点问题和难点 2、不连续体系SDS- PAGE电泳中的样品浓缩效应： 凝胶孔径不连续性：在2层凝胶中样品/浓缩胶为大孔径胶，分离胶为小孔径胶；在电场作用下，被分离物在大孔径中移动遇到阻力小，移动速度快，当进入小孔径胶时，被分离物移动受到阻力大，移动速度变慢，因而在两种胶