hplc-uv-esi-ms-tlc联用筛选 - 中山大学化学与化学工程学院.doc

HPLC-UV-ESI-MS-TLC联用筛选 乙酰胆碱酯酶抑制剂 朱桃玉 马志玲* （中山大学化学与化学工程学院，广州 510275） 摘要 寻找新的中枢拟胆碱药尤其是乙酰胆碱酯酶抑制剂是治疗早老年痴呆病研究的重点之一。本文以合成的乙酰胆碱酯酶抑制剂混合物为研究对象，研究薄层色谱、高效液相色谱以及液相－质谱法在筛选抑制剂化合物中的应用，从而建立了一套完整的抑制剂的筛选方法，对寻找新的酶抑制剂有着重要的指导性意义。 关键词 老年痴呆症 乙酰胆碱酯酶 筛选 1 前言 阿尔茨海默病（Alzheimers，AD）（ACh）AD病的主要途径是寻找新的中枢拟胆碱药，乙酰胆碱酯酶抑制剂就是其中的一类。不少报道指出，寻找乙酰胆碱酯酶抑制剂，从而减少乙酰胆碱的降解，对于治疗AD病有明显的功效，因而，越来越多的乙酰胆碱酯酶抑制剂被用于AD病的临床症状的治疗[1]。 胆碱酯酶抑制剂是一类能与胆碱酯酶（ChE）ChE活性的药物（也称抗胆碱酯酶药）。其作用是使胆碱能神经末梢释放的Ach堆积，表现M样及N样作用增强而发挥兴奋胆碱受体的作用，故该类药又称拟胆碱药。 本实验以合成的乙酰胆碱酯酶抑制剂混合物为研究对象，把高效液相色谱法（HPLC）（MS）（HPTLC）mmol/L的甲醇溶液。吸取20 μL注入高效液相色谱仪中，按照一定色谱条件进行测定，从而确定该样品体系中各种抑制剂化合物的相对含量。样品溶液须经0.45 μm *基金项目 中山大学化学与化学工程学院第四届创新化学实验基金项目（批准号：03037）资助 第一作者 朱桃玉（1981年出生），女，中山大学化学与化学工程学院2000级 指导老师 马志玲副教授 Email：cesmzl@zsu.edu.cn 滤膜方可上机。 2.2液相－质谱联用法定性测定各抑制剂化合物 将抑制剂样品配成1 mmol/L的甲醇溶液，经高速离心机离心后，吸取上层清液进样，在一定色谱条件下进行测定。 2.3 二维薄层色谱法分离测定各化合物的抑制活力 将抑制剂混合配成1 mmol/L的甲醇溶液，吸取2.5 μL在2.5×10 cm的薄层板上进行点板，然后在最佳二维展开剂体系中展开。逐次喷上2 mg/mL的氯化乙酰胆碱和4 mg/mL的DTNB溶液，使得整块硅胶被饱和而其上的样品斑点不至于脱落。自然放置5 min，使硅胶板晾干。最后喷上0.1 mg/mL的酶溶液。大概5 min后可以看到黄色硅胶板上出现白点，这些白点即代表具有抑制能力的各种化合物。该现象应在15 min内观察记录，20-30 min内会自然消失[2]。 3 结果与讨论 3.1高效液相色谱法分离混合物 图1 混合物经HPLC分离的色谱图 结论：从图 1可以得知，各种物质都得到了很好的分离。对于各种不同物质的相对含量见表1。 表1 各种物质的相对含量的测定结果 Time Area Height Width W% 9.275 1017.5 65.4 0.2274 16.6375 11.775 2339.5 229.9 0.1387 38.2534 13.080 1669.8 264.6 0.0956 27.3026 19.880 108.3 20.7 0.0771 1.7712 20.066 270.9 56.2 0.0722 4.4300 为了优化高效液相色谱条件，本实验还探讨了pH、离子对试剂的浓度以及三乙胺的体积百分含量对整个分离的影响。 3．2 液相－质谱法定性测定各种抑制化合物 通过液质联用技术，本实验得到了该抑制剂混合物体系的液相色谱图和质谱图。同时借助了氢谱，从而确定了各种化合物的分子量和分子结构。 结论：通过实验得到不同保留时间处的物质的分子结构如下： （1） （2） （3） （4） 其中，（1）、（2）、（3）、（4）分别为保留时间9.275、11.775、13.080、20.066所对应的结构式。而19.880的结构式有待进一步确定。 3.3薄层色谱法初步分离测定各种化合物的抑制活力 对于本实验研究的混合体系，通过薄层色谱法可以粗略得出保留时间分别为19.880和20.066时的化合物的抑制能力最强；其次是保留时间分别为9.275、11.775和13.080时的化合物，而这三者的抑制能力相似。 本实验得出了用薄层色谱法来筛选本样品体系的最小检测量为0.05 μg～0.1 μg，而用紫外检测的最小检测量为0.5～0.6 μg。因此，用薄层色谱法来分析鉴别各种具有抑制能力的化合物是可行、有效和快速的方法。实验结果见图2。 图2 TLC法鉴别具有抑制活力化合物的实验结果 致谢 本工作得到中山大学化学与化