7-sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量.doc

本次实验项目： SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量 本次实验课时：8学时 实验类型：设计性 教学要求： 用SDS－PAGE法测定样品中蛋白质相对分子质量； 熟悉操作过程；掌握实验方法；明确实验原理。 够根据实验目的进行整个实验过程的设计与操作，如标准蛋白质的选择、分离胶与浓缩胶浓度的确定与制备、灌胶、样品的处理、上样量及方法的选择、电泳时电压的控制、染色与脱色时间的确定、并能够对电泳过程中出现的问题加能解决，能够独立思考分析电泳结果，总结本实验成功与失败的原因。 重 点： 实验原理、整个实验过程的设计与操作，如标准蛋白质的选择、分离胶与浓缩胶浓度的确定与制备、灌胶、样品的处理、上样量及方法的选择。 教学手段及教具：课堂讲授，学生实验操作。 讲授内容及时间分配： 课堂讲授 1．相关知识……………………………………………………………　　……　 0.1 学时 2．实验目的…………………………………………………………………　　… 0.3学时 3．实验原理……………………………………………………………………　　 0.3 学时 4．实验操作　　　　　……………………………………………………　　… 0.3 学时 实验教学 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量实验的操作技术………　7　学时 参考资料 《生物化学实验》 　　　　　　　实验教学教案首页 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量（设计性） 相关知识 1.电泳？　2.影响电泳速率的因素？　3.SDS的作用？　4.β－乙醇的作用？ 2．聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 3.分类：自然胶电泳、变性胶电泳、等电聚焦电泳、梯度胶电泳、双向电泳、印迹转移电泳。 4.不连续缓冲系统：SDS－PAGE电泳体系为不连续电泳体系。DS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围 蛋白质相对分子质量范围 分离胶的浓度 ＜104 20%　~　30% 1×104　~　4×104 15%　~　20% 4×104　~　1×105 10%　~　15% 1×105　~　5×105 5%　~　10% ＞5×105 2%　~　5% *双丙烯酰胺～丙烯酰胺摩尔比为 1：29。 常用的标准蛋白质的Mr 蛋白质名称 Mr（D） 蛋白质名称 Mr（D） 牛血清清蛋白 66200 牛胰凝乳蛋白酶原 25000 鸡卵清蛋白 43000 溶菌酶 14300 猪甲状腺球蛋白 669000 猪胃蛋白酶 35000 马心细胞色素c 12500 马肺铁蛋白 440000 牛肝过氧化氢酶 232000 牛心乳酸脱氢酶 140000 兔磷酸化酶B　 97400 兔肌动蛋白 43000 胰蛋白酶抑制剂 20100 牛碳酸酐酶 31000 不同分离胶的配制方法 分离胶的浓度 20% !5% 12% 10% 7.5% 重蒸水 0.75 2.35 3.35 4.05 4.85 1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)/ml 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 质量浓度为10%SDS/ml 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 凝胶贮备液(Acr/Bis)/ml 6.6 5.0 4.0 3.3 2.5 质量浓度为10% AP/ul ８0 ８0 ８0 ８0 ８0 TEMED/ ul 6 6 6 6 6 总体积/ml 10 10 10 10 10 5%浓缩胶的配制方法 重蒸水 2.92 0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)/ml 1.25 质量浓度为10%SDS/ml 0.05 凝胶贮备液(Acr/Bis)/ml 0.8 质量浓度为10% AP/ul 40 TEMED/ ul 6 总体积/ml 5 注意：根据实验目的、实验要求、实验条件在实验前写出实验设计方案 实验目的、实验要求、实验条件 实验目的 用SDS－PAGE法测定样品中蛋白质相对分子质量； 熟悉操作过程；掌握实验方法；明确实验原理。 实验要求 1.能够根据实验目的进行整个实验过程的设计与操作，注意几个设计点: ①如标准蛋白质的选择依据；②分离胶的确定与制备：浓度大小的依据是？分离胶配制量多少的依据是？③灌胶方法的选择？④上样量的确定：依据蛋白质浓度大小确定上样量，一般是样品在含1~6种蛋白且各占比例相当的情况下浓度在1~2mg/ml时、对凝胶大小在8×8.2时，上样量为10~20ul；⑤电泳时电压控制多大的选择；⑥能够对实验过程中出现的问题加能解决，能够独立思考分析电泳结果，总结本实验成功与失败的原因。 2．利用标准曲线计算出待测蛋白质样品的Mr。 实验条件 1．实验所需的实验试剂和材