冠脉结扎法制作大鼠心肌缺血模型346.docVIP

冠脉结扎法制作大鼠心肌缺血模型 1.1　实验材料 1.1.1　实验动物　清洁级Wistar近交系大鼠100只(购自中国科学院上海实验动物中心)，均为雄性，体重245～320g(平均278.2±22.2g)，饲养环境为清洁级。 1.1.2　试剂　3%戊巴比妥钠，1%肝素钠，Evans蓝和N-BT磷酸缓冲液(Sigma公司)。 1.1.3　实验仪器　心电图机，动物呼吸机(浙江医科大学医疗仪器设备厂，DH150型动物呼吸机)，Buxco系统(Buxco公司)。 1.2　1.2.1　动物分组　根据研究目的，实验动物共分六组；其中五个组需手术制作模型，合称手术组，另一个组为假手术组。为满足每组12只的要求，先后有100只动物随机进入手术组(85只)与假手术组(15只)。 1.2.2　制作方法 1.2.2.1　手术组　用3%戊巴比妥钠(30mg/kg)行腹腔注射麻醉，麻醉满意后置于手术台，四肢及头部仰卧固定于手术台上，四肢皮下连接心电图电极，记录标准Ⅱ导联心电图，颈部皮肤备皮消毒，胸骨上窝上正中切开皮肤0.5cm，向上钝性分离推开下颌下腺，剪除气管前肌肉，使气管在没有任何拉钩牵引的情况下能充分显露，彻底止血后于第2～3气管环间行气管横行切开，注意不要切断气管软骨环，切口长度不超过气管周径的1/3，擦干其内分泌物后插入气管插管(用小儿吸痰管自制)，深度为0.5～1cm。连接空气呼吸机进行人工控制呼吸，呼吸频率90次/分，潮气量10～12ml，吸呼比设为1﹕1。左前胸去毛，消毒铺巾，顺肋间隙方向于胸骨左旁第3～4肋间切开皮肤，长约1cm，逐层分离皮下组织、肌肉，于2～3肋骨间撑开进胸，向右上方推开胸腺，可暴露心脏及大血管根部，切开心包，轻挤大鼠胸廓，将心脏挤出，有部分动物在左心耳下缘与肺动脉圆锥间可以看见左冠脉前降支起始部，用6-0Prolene线缝针，进针深度控制在0.1cm，宽度为0.1～0.2cm(图1)；回纳心脏入胸廓，待动物的数十次心动周期后，收线打结；观察数分钟后，彻底止血后逐层关胸。关胸过程中于切口内放置排气管(用小儿头皮针的软管自制)，关胸毕，抽空胸腔积气后拨除。恢复大鼠自主呼吸，拨出气管内插管，清除气管内分泌物，气管切口及颈部切口开放，不作缝合。手术过程中分开胸后、缝针后、结扎后和关胸后四个点记录心电图变化；合格动物2周及6周后均复查心电图。以上手术均在严格无菌条件下进行。术后肌肉注射青霉素钠20万单位/d，连续5天抗感染。 1.2.2.2　假手术组　仅在左心耳下缘与肺动脉圆锥间左冠脉前降支位置取同样大小的针缝针而不打结，余操作与手术组同。 1.3　心功能检测　模型制作6周后(干预治疗4周后)，再次3%戊巴比妥30mg/kg腹腔内注射麻醉。原切口进胸，分离粘连，显露心尖，将含肝素液导管自心尖向心底方向插入左心室腔内，导管另一头连接于压力换能器，导入Buxco系统描记左心室压力(LVP)曲线，测得左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP)，同时将LVP电信号同步输入微分器，描记曲线，测得左心室等容收缩期室内压最大上升速率(+dp/dtmax)、左心室等容舒张期室内压最大下降速率(-dp/dtmax)。 1.4　心梗面积的计算　除模型评估亚组动物全部计算心梗面积外，余各亚组及假手术组各取4只计算面积。心功能检测毕，自左室导管注入10%氯化钾1ml，使心脏停止在舒张期，再以5%的Evans蓝2ml注入，以区分心肌的心梗区(不染色)和非心梗区，立刻剪下心脏，用生理盐水灌洗，并除去心房与右室组织，称重。与左室长轴垂直作连续切片，每隔2mm一张；放入0.1%的N-BT磷酸缓冲液(pH7.4)37℃水浴30min，梗死心肌细胞中脱氢酶因细胞膜损伤而完全释放而丢失，不能使N-BT还原染色，因而梗死心肌不被染色，残余存活心肌则被染成蓝色(图2)。染色后再用生理盐水冲洗，将未着色的缺血(缺血)区域小心切下，并称湿重。用以下公式计算缺血心肌占全心重量的百分比：心肌梗死范围(%)＝(未着色缺血区域湿重/全心湿重)×100%。 1.5　统计学方法　数值变量以±s表示，组间均数以t检验，所有计算在统计软件SPSS11.0上进行，取α＝0.052.1　死亡率　假手术组15只动物，死亡1只，原因为失血性休克。85只手术组动物中在24小时内11只死亡，死亡率为12.9%(11/85)，死亡原因有急性心衰(5例)、失血性休克(3例)、呼吸衰竭、心律失常和麻醉意外(各1只)；另对照亚组与模型评估亚组各2只于实验第4～5周死亡，死亡原因为慢性心衰，这4只动物均纳入术后6周心梗面计算中。 2.2　合格情况　心电图以结扎前(图3As、3Ao)为正常，以利判别，存活的14只假手术组动物均合格，心电图(图3Bs)及术中肉眼观正常，任选12只进入研究，6周后心脏