分型技术简介(高遄).pptVIP

5.3.1TaqMan 技术 特点： 优点：不需要分离或洗脱过程，提高了实验速度，同时减少了PCR 污染的可能性；操作简单快速，特别适合少量位点大量样本（几千个）的分型项目。 缺点：不适合多位点少量样本（几十个）分型, 特别是频率偏低的位点；不能同时采用两个及两个以上的探针同时进；探针成本较高，实验花费大 5.3.2连接酶检测（LDR） 原理： 基于耐高温连接酶的SNP快速检测技术。 当探针与目的DNA互补配对后，连接酶能通过催 化磷酸二酯键将相邻的两根探针连接；当探针DNA 的接头处存在碱基错配，连接反应便不能进行。 5.3.2连接酶检测（LDR） (1)多重PCR (Multiplex PCR)获得含有待检测突变位点的基因片断 (2)多重LDR (Multiplex LDR) (3)通过测序仪电泳读取检测结果 5.3.2连接酶检测（LDR） 优化后的LDR技术---新型通用探针LDR分型技术 P1×2：两组检测探针(一个SNP含2个P1) P2:一组下游探针 以1：1：1摩尔比混合称为位点探针 一组通用荧光探针 一组通用模板 以1：1摩尔比混合称为通用探针 设计不同位点和不同基因型探针连接产物的序列长短是已知的，并且有3n bp的差异。 在特定的基因型中，相应的检测探针与目的DNA完全互补，检测探针，下游探针和通用荧光探针分别和目的DNA以及通用模板杂交，并且连接成完整的DNA单链。 根据探针的设计，不同的基因型会产生不同长度的连接产物，所以根据单链的长度可以判断该位点的基因型 如果同时出现两条相差3 bp的单链，则该位点的基因型为杂合子。如果没有目的DNA，则只有下游探针和通用荧光探针能连接成产物。 5.3.2连接酶检测（LDR） 特点： 优点：灵敏度高，特异性强，结果峰图直观，相对成本比Taqman技术低。 缺点：高通量应用中探针合成成本过高。 5.3.3基因芯片 原理： 任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解为一个序列固定、错落而重叠的寡核苷酸，又称亚序列（subsequence）。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5个8 nt亚序列： 这5个亚序列依次错开一个碱基而重叠7个碱基。 亚序列中A、T、C、G 4个碱基自由组合而形成的所有可能的序列共有65536种。 假如只考虑完全互补的杂交，那么48个8 nt亚序列探针中，仅有上述5个能同靶DNA杂交。 可以用人工合成的已知序列的所有可能的n体寡核苷酸探针与一个未知的荧光标记DNA/RNA序列杂交，通过对杂交荧光信号检测，检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸，从而推出靶DNA中的所有8 nt亚序列，最后由计算机对大量荧光信号的谱型（pattern）数据进行分析，重构靶DNA 的互补寡核苷酸序列。 5.3.3基因芯片 一组寡核苷酸探针 — TATGCAATCTAG CGTTAGAT ACGTTAGA ATACGTTAGATC TACGTTAG 由杂交位置确定的一组 核酸探针序列 GTTAGATC 杂交探针组 TATGCAATCTAG 重组的互补序列 靶序列 TACGTTAG ACGTTAGA ATACGTTA CGTTAGAT GTTAGATC ATACGTTA 5.3.3基因芯片 基因芯片 荧光标记的样品 共聚焦显微镜 获取荧光图象 杂交结果分析 探 针 设 计 杂交 5.3.3基因芯片 特点： 优点：信息量大；自动化程度高。 局限性：芯片造价高昂, 所需设备贵重, 不利于普及应用。 5.3.3基因芯片 5.4光谱或电子信号 5.4.1直接测序法 MALDI - TOF 质谱分析 变性高效液相色谱技术 (DHPLC) 纳米探针电路检测原理 5.4.1直接测序法 对于一些比较小、外显子相对较少的基因的SNP 检测可直接测序,其检测效率可以达到100 % 。 其主要流程是: PCR 扩增目的片段 纯化、回收 4种荧光标记(ddNTP) 测序反应 过柱去除多余的荧光和引物 测序仪上电泳并用测序软件分析。 总结 理想的SNP检测技术： 适合自动化操作, 简便快速; 分析费用低, 特殊试剂少; 反应要精密, 不纯的样品也可以可靠的分析; 数据分析简单, 易于自动化; 反应的通量大而灵活。 参考文献 [1]贾玉艳,陈宏. SNP 分子标记的研究及应用[J] . 黄牛杂志,2003 ,29(1) :42 -45. [2]罗怀容,施鹏,张亚平. 单核苷酸多态性的研究技术[J] . 遗传,2001 ,23 (5) :471 - 476. [3]高爱保,肖剑,吴登俊. SNPs 基因分型技术[J].生物技术,2004,14(3):63-65 [4]侯振平,蒋思文.单核苷酸