DNA末端标记.PPT

常用的生化遗传标记基因： 1.β-半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β-半乳糖苷酶基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β-半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为标记基因。 β-半乳糖苷酶基因的优点: a.?酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观； b. lacZα编码5‘-端可容许很大的变化而不影响酶活性； c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大。 2.葡萄糖苷酸酶基因（GUS） 该基因编码一种可分解各种β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。该标记基因除具有上述lacZ基因的优点外，它的适用范围十分广泛，因为许多生物中没有这种基因。 3.荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发光细菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。 4.发光蛋白质基因(GFP) 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使大肠杆菌菌落发绿色荧光。 噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。有的噬菌体基因组较大，如λ噬菌体和T噬菌体等；有的则较小，如M13、f1、fd噬菌体等。其中用感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的载体应用最为广泛。 噬菌体或病毒的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为： 1.高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞； 2.自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。 λ噬菌体的基因结构和功能 λ噬菌体的改造和构建 基因组太大（49kb），酶切点太多，如有5个BamH1位点（G↓GATCC，只能接纳一定长度的DNA，即相当于λ噬菌体的75-105%，那么只能接纳49kb×5%=2.45kb的DNA， 重组的λDNA分子难于直接导入宿主细胞. λ-DNA作为载体的优点 1.λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌。 2.λ-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量。 3.重组λ-DNA分子的筛选较为方便。 柯斯质粒的优点： 1.具有λ噬菌体的特性(体外包装，高效感染进入受体细胞)； 2.具有质粒载体的特性(易于克隆操作、也能转化进入受体细胞、选择及高拷贝等)； 3.具有较高容量（45 kb）的克隆能力； 4.排斥非重组子； 5.不能体内包装，不裂解受体细胞，不形成噬菌体颗粒，因而不形成噬菌斑。 常用的噬菌粒载体pUC18和pUC19 1. 具有较小分子量，可克隆10kb左右的外源DNA片段，并易于进行分离与操作； 2. 编码一个ampr基因作为选择记号便于转化子的选择； 3. 拷贝数高，每个寄主可高达500个，所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体DNA； 4. 存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上； 5. 由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5’-端编码区，可通过化学显色反应，筛选重组子； 6. lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，这样插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达； 7. 含有质粒的复制起点，在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规的方式，复制形成大量的双链DNA分子； 8. 带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中； 9. 在pUC18和pUC19这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录出负链DNA； 10. 可以直接对克隆的DNA片断进行核苷酸的序列测定，免去了从质粒载体到噬菌体的这一烦琐的亚克隆步骤。 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb 的DNA片段，此时柯斯质粒(45kb)和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区（着丝粒）、稳定区（端粒）与质粒组装