重组技的基本工具.ppt

* * 一、在基础理论上取得重大突破 1.DNA是遗传物质的证明 2.DNA双螺旋结构和中心法则的确立 3.遗传密码的破译 二、技术发明使基因工程的实施成为可能 1.基因转移载体的发现 2.工具酶的发现 3.DNA合成和测序技术的发明 4.DNA体外重组的实现 5.重组DNA表达实验的成功 6.第一例转基因动物的问世 7.PCR技术的发明 该技术就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。又叫基因拼接技术或DNA重组技术。 （一）基因工程的概念 ①目的性强，定向改变生物，培育新品种； ②能克服生物远源杂交不亲合障碍。 优点： 实质 结果 基本过程 操作水平 操作对象 操作环境 基因工程的别名 基因拼接技术或DNA重组技术 生物体外 基因 DNA分子水平 人类需要的基因产物 剪切 → 拼接 → 导入 → 表达 基因重组 基因工程培育抗虫棉的简要过程： 普通棉花(无抗虫特性) 苏云金芽孢杆菌 提取 抗虫基因 与运载体DNA拼接 导入 棉花细胞(含抗虫基因) 棉花植株(有抗虫特性) 1:提取抗虫基因需要: 基因的剪刀——限制性核酸内切酶 2:抗虫基因与运载体DNA连接需要: 基因的针线——DNA连接酶 3:抗虫基因导入受体(棉花)细胞需要: 基因的运载工具——运载体 1. 限制性核酸内切酶——“分子手术刀” 限制性核酸内切酶(简称限制酶) 是在生物体(主要是微生物)内的一种酶，能将外来的DNA切断。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶。 特点：特异性。 即一种限制性核酸内切酶(简称限制酶)，只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。 （二）DNA重组技术的基本工具 限制性核酸内切酶切割点 限制酶 大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。 黏性末端：指被限制酶切开的DNA两条单链的切口上所带有几个伸出的核苷酸。 游离片段 要想获得某个特定的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？ 要切两个切口，产生四个黏性末端。 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？ 会产生相同的黏性末端。然后让两者的黏性末端黏合起来，就可以合成重组的DNA分子。 2. DNA连接酶——“分子缝合针” DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来。即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样就形成了一个重组的DNA分子。 外源基因(如抗虫基因)怎样才能导入受体细胞(如棉花细胞)？ 导入过程需要运输工具——运载体。 运载体的作用有哪些？ 作用1：作为运载工具，将外源基因(抗虫基因)转移到受体细胞(棉花细胞)中去。 作用2：利用运载体在受体细胞(棉花细胞)内，对外源基因(抗虫基因)进行大量复制。 作为运载体必须具备哪些条件？ 1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存 2）载体DNA必须有一个或多个限制酶切点，以便于目的基因插入载体中 3）具有某些标记基因，便于进行筛选，如对抗菌素的抗性基因 载体DNA必须是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去 5) 载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作 3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 常用的运载体主要有两类： 1）细菌细胞质的质粒 2）λ噬菌体的衍生物和动植物病毒 质粒是能够自我复制的小型环状DNA分子。现在专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中核以外的DNA分子。是基因工程最常用的运载体，常需人工改造。 大肠杆菌的质粒： 最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，常含有抗药性基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等标记基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内完成。 双基练习： 1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀” (1)主要来源:从____生物中分离出来的 (2)特点:能够识别DNA特定的核苷酸序列，切开两个____之间的_____ 。 (3) DNA末端:限制酶切割DNA产生的DNA末端有两种形式:______和_______。 2. DNA连接酶——“分子缝合针” (1)作用:将双链DNA片段 ，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_____