转基因作物pat 蛋白的双抗体夹心酶联免疫检测方法研究 - 分析化学.pdf

第4 1 卷 分析化学 (FENXI HUAXUE )摇 研究报告 第10 期 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2013 年10 月 Chinese Journal of Analytical Chemistry 1555 ~1560 DOI:10.3724/ SP.J.1096.2013.30236 转基因作物pat 蛋白的双抗体夹心酶联免疫检测方法研究 1,2 2 2 2 2 *2 *2 王 敏 摇 张 亮摇 张 威摇 曹振 摇 谭桂玉摇 南铁贵 摇 王保民 1(北京工商大学 理学院生物技术系,北京市植物资源重点实验室,北京 100048) 2(中国农业大学 农学与生物技术学院,北京 100093) 摘摇 要摇 将克隆到的pat基因构建原核表达载体pET30(+)鄄pat并在大肠杆菌中进行表达,分离纯化得到高 4 纯度pat蛋白。 用所得到的pat蛋白制备了兔多克隆抗体和鼠单抗2F6。 多抗效价8000,单抗效价为5伊10 ; 单抗为IgG1类,轻链为资型。 基于抗pat蛋白单克隆抗体和兔多克隆抗体建立了双抗夹心酶联免疫分析方 法(Sandwich ELISA)。 检测范围为1.6~100 滋g/ L,线性回归方程y=0.6914x-2.572,决定系数为0.9951。 用 所建立的方法测定了5个转基因抗虫棉和2个非转基因棉花品种叶片中pat蛋白的含量,其中转基因抗虫棉 中的3个品种检测出pat蛋白,其余均未检出pat蛋白。 关键词摇 转基因作物;pat基因;pat蛋白;双抗夹心酶联免疫检测法 1摇 引摇 言 pat基因(Hosphinothricin acethl transferase)由菌株S. viridochromogenes 中分离得到,其 Bg/ 11鄄Ss域 片段编码pat蛋白,通过使乙酰辅酶A与草丁膦游离的氨基结合,形成AC鄄pat复合物,从而使草丁膦失 [1] 去活性 。 pat 基因编码表达产物pat 蛋白分子量约为23 kDa,为同源二聚体,由183 个氨基酸组 [2] [3] 成 ,属于乙酰转移酶家族,与乙酰转移酶类具有相对相同的结构和功能 。 pat 蛋白无直接毒性,与 已知的毒蛋白无同源性,也不具过敏原的特性,如热或消化稳定性、无糖基化位点等,且在植物中的表达 [3] 量极低 ,因此该基因片段也被作为一般转基因作物的标记基因。 转基因作物及其产品的检测方法主要有基于核酸水平的检测方法和基于蛋白质水平的免疫学检测 [4] [5,6] 方法 。 核酸检测方法通过检测插入的外源基因,以聚合酶链式反应(PCR)为主 ,包括巢式 [7] [8] [9] [10] [11] PCR 、多重PCR 、竞争性定量PCR 、实时定量PCR 、和基因芯片 等多种检测技术手段。 蛋白 [12,13] [4] 质水平检测方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)