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外源化学物所致肝脏损伤及机制探讨 南京医科大学公共卫生学院卫生毒理学系 实验总目的 培养学生观察问题、分析问题、解决问题及整体科研思维和能力 熟悉毒理学整套动物实验过程，全面掌握毒理学基本理论、基本知识和基本操作 实验主要内容 本实验以四氯化碳所致肝脏急性损伤作用及其机制探讨为例，从如何建立动物急性染毒模型开始，通过检测机体有关肝脏损伤指标及脂质过氧化机制指标，比较、分析肝脏损伤指标与脂质过氧化指标之间的关系，从而探讨脂质过氧化是否为四氯化碳所致肝脏损伤机制之一 （一）实验目的 了解化学毒物的剂量选择原则 掌握急性动物染毒模型的基本操作技术 （一）实验目的 掌握比色法测定血清ALT酶活性方法 分析比较不同剂量四氯化碳急性染毒对血清ALT的影响及意义 （一）实验目的 （一）实验目的 掌握硫代巴比妥酸（TBA)比色法测定肝组织LPO含量方法 分析比较不同剂量四氯化碳急性染毒对肝脏LPO的影响及意义 （一）实验目的 掌握核黄素光照比色法测定肝组织SOD酶活性方法 分析比较不同剂量四氯化碳急性染毒对肝脏SOD酶活性的影响及意义 （一）实验目的 取带塞比色试管，按下表加入各试剂 （三）实验步骤 充分振荡1 min，转入另一离心管，以3000 rpm离心10 min，取上清液于532 nm波长处，经空白管调零，测定样品管和标准管吸光度值 5.0 5.0 5.0 正丁醇-吡啶（ml） 用力振动充分混匀、塞盖、置95℃水浴60 min，水浴取出后，自来水流冷却 0.6 0.6 0.6 蒸馏水（ml） 1.5 1.5 1.5 0.8% TBA（ml） 1.5 1.5 1.5 醋酸盐缓冲液（ml） 0.2 0.2 0.2 8.1% SDS（ml） 0.2（TEP应用液） 0.2 0.2(匀浆缓冲液) 10％肝匀浆（ml） 标准管 样品管 空白管 试 剂 3.计算： 多种外源化学物进入机体，可引起体内自由基增多或机体抗氧化功能降低，从而使机体产生脂质过氧化损伤，引起组织LPO含量升高 分析比较不同染毒剂量组与对照组组织LPO含量的变化，观察外源化学物对组织脂质过氧化损伤的影响 4.意义： 在LPO与TBA反应显色过程中，要求在沸水浴中加热，操作小心以避免沸水烫伤 为使反应完全，在加热过程中，不断振摇混匀 （四）注意事项 * 实验内容五 肝组织超氧化物歧化酶（SOD）活性测定 核黄素光照产生的超氧阴离子自由基与羟胺反应生成亚硝酸根，在酸性条件下，亚硝酸与氨基苯磺酸和N-甲萘基二氨基乙烯反应生成红色化合物，而SOD可抑制此反应，根据抑制率高低，计算SOD活性。因CuZn-SOD在1～2 mmol/L NaCN存在下完全失活，而Mn-SOD活性不变，故在测定体系中，根据NaCN存在与否，可测出总SOD(T-SOD)和Mn-SOD活性，从而计算出CuZn-SOD活性 （二）实验原理 按下表操作 （三）实验步骤（1） 30℃水浴20 min，于550 nm波长处，以蒸馏水调零，测定对照管与测定管吸光度值 2.0 2.0 2.0 2.0 试剂C（ml） 30℃，距离6 cm，光照5 min 1.0 1.0 试剂B（ml） 1.0 1.0 试剂A（ml） A A(蒸馏水) A A(蒸馏水) 样品（ml） 测定管 对照管 测定管 对照管 T-SOD Mn-SOD 试 剂 3.计算： 定义：每mg组织蛋白在1 ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个亚硝酸盐单位 组织匀浆中SOD活性（U/mg蛋白）为 组织匀浆蛋白含量按Lowry方法测定 SOD是细胞内重要抗氧化酶，在清除自由基、拮抗外源化学物对机体损伤及维持自身内环境稳定上均具有重要作用。不同组织样本SOD活性不同，当外源化学物进入机体引起组织中SOD活性降低，使机体不能及时有效清除体内过多活性氧（ROS）自由基，从而引起机体产生过氧化性损伤 4.意义： NaCN是剧毒物质，操作时要小心，并妥善保管好 因SOD活性是通过抑制超氧阴离子自由基产生而计算的，所以在操作过程中要严格按程序操作，控制操作时间，否则影响实验准确性 （四）注意事项 * 实验内容六 肝组织还原型谷胱甘肽（GSH）含量测定 掌握DNTB法测定肝组织GSH含量方法 分析比较不同剂量四氯化碳急性染毒对肝脏GSH的影响及意义 GSH和5，5’-二硫代二硝基苯甲酸（DNTB）作用生成5’-硫代二硝基苯甲酸阴离子，呈现较稳定的黄色，在410 nm波长处测定其吸光度值，并与相应处理的GSH标准比较，即可求得样本中GSH含量 （二）实验原理 * * 卫生毒理学设计性、综合性实验 刘起展 脂质过氧化在四氯化碳所致肝脏损伤机制中发挥重要作用 小鼠四氯化碳 急性中毒模型 检测肝脏损伤指标 如ALT和TG 四氯