高通量筛选酸敏感离子通道1a抑制剂研究 - 中国全科医学.pdf

　 　　　　　　　　　　　　　　　　　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗｃｈｉｎａｇｐｎｅｔ　Ｅｍａｉｌ：ｚｇｑｋｙｘ＠ｃｈｉｎａｇｐｎｅｔｃｎ ·２０３３· ·论著 · 高通量筛选酸敏感离子通道 １ａ抑制剂研究 羿 菲，李小曼，白 宁，孙 威，姜 波，张 莹，宋晓宇 　　 【摘要】　目的　建立体外稳定过表达酸敏感离子通道１ａ（ＡＳＩＣ１ａ）的Ｆｉｓｈｅｒ大鼠甲状腺上皮细胞 （ＦＲＴ细胞）， ２＋ 采用Ｃａ 敏感荧光染料Ｆｕｒａ２／ＡＭ和细胞毒性检测 〔乳酸脱氢酶 （ＬＤＨ）释放法〕测定ＡＳＩＣ１ａ活性，探讨高通量筛选 ＡＳＩＣ１ａ抑制剂的可行性。方法　２０１４年 １月—２０１６年 ２月，利用分子生物学方法，构建 ＡＳＩＣ１ａ过表达载体 ｐｃＤＮＡ３１／ｍｙｃＨｉｓｍＡＳＩＣ１ａ，通过细胞转染技术建立了稳定过表达ＡＳＩＣ１ａ的Ｆｉｓｈｅｒ大鼠ＦＲＴ细胞。将细胞分成两组， ２＋ 对照组 （ＦＲＴ细胞）和实验组 （稳定过表达 ＡＳＩＣ１ａ的 ＦＲＴ细胞），并分别未负载和负载 Ｃａ 敏感荧光染料 Ｆｕｒａ２／ＡＭ，采用酶标检测仪测定双波长 （３４０ｎｍ和３８０ｎｍ）的值，计算Ｆ３４０／Ｆ３８０。对照组和实验组细胞经不同ｐＨ 值酸液 （ｐＨ值７５、７０、６５、６０、５５）刺激后，采用酶标检测仪测定４５０ｎｍ波长处ＬＤＨ释放量。结果　对照组 与实验组未负载Ｆｕｒａ２／ＡＭ细胞 Ｆ３４０／Ｆ３８０比较，差异无统计学意义 （Ｐ＞００５）；实验组负载Ｆｕｒａ２／ＡＭ细胞 Ｆ３４０／ Ｆ３８０较对照组升高 （Ｐ＜００５）；对照组和实验组负载Ｆｕｒａ２／ＡＭ细胞 Ｆ３４０／Ｆ３８０较未负载Ｆｕｒａ２／ＡＭ细胞升高 （Ｐ＜ ００５）。ｐＨ值６５、６０、５５时，实验组细胞ＬＤＨ释放量大于对照组 （Ｐ＜００５）；对照组和实验组细胞不同ｐＨ值时 ２＋ ＬＤＨ释放量比较，差异有统计学意义 （Ｐ＜００５）。结论　本研究成功建立稳定过表达ＡＳＩＣ１ａ的ＦＲＴ细胞，Ｃａ 敏感 荧光染料Ｆｕｒａ２／ＡＭ和细胞毒性检测 （ＬＤＨ释放法）两种方法测定ＡＳＩＣ１ａ活性，使高通量筛选ＡＳＩＣ１ａ抑制剂成为可 能，为发现高选择性和高活性的天然小分子ＡＳＩＣ１ａ抑制剂奠定了基础。 　　 【关键词】　高通量筛选分析；酸敏感离子通道１ａ；上皮细胞；乳酸脱氢酶 　　 【中图分类号】Ｒ９６５１　 【文献标识码】Ａ　ｄｏｉ：１０３９６９／ｊｉｓｓｎ１００７－９５７２２０１６１７０１１ 　　 羿菲，李小曼，白宁，等．高通量筛选酸敏感离子通道 １ａ抑制剂研究 ［Ｊ］．中国全科医学，２０１６，１９（１７）： ２０３３－２０３７．［ｗｗｗｃｈｉｎａｇｐｎｅｔ］ 　　 ＹｉＦ，ＬｉＸＭ，ＢａｉＮ，ｅｔａｌ．ＨｉｇｈｔｈｏｕｇｈｔｏｕｔｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆＡＳＩＣ１ａｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＧｅｎｅｒａｌＰｒａｃｔｉｃｅ，２０１６，１９ （１７）：２０３３－２０３７． ＨｉｇｈＴｈｏｕｇｈｔｏｕｔＳｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆＡＳＩＣ１ａＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ＹＩＦｅｉ，ＬＩＸｉａｏ－ｍａｎ，ＢＡＩＮｉｎｇ，ｅｔａｌ．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＣｈｉｎａＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０１２２，Ｃｈｉｎａ ２＋ 　　 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｔｈｅＦＲＴｃｅｌｌｏｆＦｉｓｈｅｒｒａｔｓｏｆｓｔａｂｌｅｉｎｖｉｔｒｏＡＳＩＣ１ａｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｃａ － ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｄｙｅＦｕｒａ２／ＡＭａｎｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙｔｅｓｔ（ＬＤＨｒｅｌｅａｓ