一株自凝集沙门氏菌的分离鉴定.pdf

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　２０１７（０３下）：１３８－１４０ 一株自凝集沙门氏菌的分离鉴定 １，２ １，２ １，２ １，２ １，２ １，２ 郑慧娟 ，郭荣显 ，田雅楠 ，陶　静 ，潘志明 ，焦新安 （１．江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏 扬州２２５００９；２．江苏省动物重要疫病 与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州２２５００９） ＋ ＋ 中图分类号：Ｓ８５２．４５；Ｓ８５２．６１２ 文献标识码：Ｂ 文章编号：１００４－７０３４（２０１７）０３－０１３８－０３ 　　沙门氏菌是具有重要公共卫生学意义的食源性 菌抗原保守的肠毒素基因（ｓｔｎ）设计引物，进行 ＰＣＲ 致病菌，在其常规的分离鉴定过程中，生化鉴定和血 扩增。上游引物：５′－ＣＴＴＴＧＧＴＣＧＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＧ－ 清学鉴定是重要的鉴定方法。在鉴定扬州市疾病预 ３′；下游引物：５′－ＴＧＣＣＣＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＧＡＴＴＣ－３′。 ［１］ 防控制中心送来的患畜腹泻样品时发现了一株自凝 预期条带大小为２６０ｂｐ ，煮沸裂解法提取菌株的 集沙门氏菌，现将分离鉴定过程报道如下。 模板ＤＮＡ，扩增其ｓｔｎ基因片段。ＰＣＲ产物经１％琼 １　材料 脂糖凝胶电泳鉴定。 １．１　样品 ２．４　血清型鉴定 　　患畜腹泻样品来自扬州市疾病预防控制中心。 　　对上述鉴定正确的沙门氏菌进行血清型鉴定。 １．２　主要试剂及菌株 首先用沙门氏菌Ａ～Ｆ群Ｏ抗原多价血清进行检测， 　　缓冲蛋白胨水（Ｂｕｆｆｅｒｅｄｐｅｐｔｏｎｅｗａｔｅｒ）培养基干 再用Ｏ抗原单因子血清检测，试验时设有阳性对照、 粉、ＭＳＲＶ培养基干粉、ＸＬＴ４ＡｇａｒＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，均购 阴性对照、生理盐水对照；Ｏ抗原确定后，挑取单菌落 自ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ公司；ＴＲＹＰＴＯＮＥ、ＹＥＡＳＴＥＸ 穿刺于半固体ＬＢ培养基，经诱导后进行Ｈ抗原多价 ＴＲＡＣＴ、Ａｇａｒ，均购自日本 ＢＩＯＳＨＡＲＰ公司；ＡＰＩ２０Ｅ 血清检测，再用Ｈ抗原单因子血清进行鉴定。 生化鉴定试剂条，购自法国生物梅里埃公司；沙门氏 ２．５　多位点序列（ＭＬＳＴ）分型 菌属诊断血清，购自宁波天润生物药业有限公司；Ｔａｑ ２．５．１　沙门氏菌基因组ＤＮＡ的提取　按照细菌基 ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ、１０×Ｂｕｆｆｅｒ，购自宝生物工程（大 因组ＤＮＡ提取试剂盒说明书提取沙门氏菌基因组 连）有限公司；细菌基因组 ＤＮＡ提取试剂盒，购自天 ＤＮＡ，置于－２０℃保存，备用。 根生化科技（北京）有限公司；德尔卑沙门氏菌 Ｒ１０ ２．５．２　沙门氏菌ＭＬＳＴ管家基因的扩增　沙门氏菌 菌株，由江苏省人兽共患病重点实验室保存。 管家基因是根据科克大学推荐使用 ＭＬＳＴ试验的 ２　方法 ７对管家基因 ａｒｏＣ、ｄｎａＮ、ｈｅｍＤ、ｈｉｓＤ、ｐｕｒＥ、ｓｕｃＡ、 ２．１　沙门氏菌的分离 ｔｈｒＡ，ＰＣＲ产物验证后送南京金斯瑞科技有限公司进 　　腹泻样品经缓冲蛋白胨水（ＢＰＷ）前增菌培养， 行测序。测序完成后用分子进化遗传分析软件 ３７℃下１００ｒ／ｍｉｎ摇震２４ｈ，取３００ Ｌ增菌液于改 Ｍｅｇａ５．０５对序列进行剪切、整理和比对，继而将分 μ 良ＭＳＲＶ半固体平板上进行选择性增菌，４２℃静置 析好的序列提交沃里克大学ＭＬＳＴ数据库进行ＳＴ型 培养