小泛蛋白样修饰物双荧光融合蛋白及其特异性蛋白酶的原核表达及鉴定.pdf

生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2009, May 25; 25(5): 701-707 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@ © 2009 Institute of Microbiology, CAS CSM, All rights reserved 医学与免疫生物技术 1* 2* 1 1 1 1 2 王晓辉 , 郭杰 , 王菊芳 , 李杉 , 孙丽华 , 王小宁 , 吕建新 1 , 510006 2 , 325035 : 本实验克隆了人的 4 种 SENP(Sentrin-specific protease)C 端催化结构域、3 种 SUMO(Small ubiquitin-like modifer) 、ECFP(Enhanced cyan fluorescent protein) 以及 EYFP(Enhanced yellow fluorescent protein) 的基因, 通过 RecJoin 克隆技术分别成功构建 SENP 和 ECFP-SUMO-EYFP 表达载体 B28 和 B13 。将表达载体转化大肠杆菌 BL21, 经 IPTG 诱导表达, 通过 Ni-NTA 离子交换柱层析纯化, 进一步采用 SDS和 Western blotting 分析鉴定, 并以酶切实验初步 分析了 SENP 相对于底物 ECFP-SUMO-EYFP 的酶切特异性。最终, SENP3C(SENP3 catalytic domain)截短表达, SENP5C 以包涵体形式表达, 其他蛋白均为可溶性表达, SDS分析表明表达产物分子质量(Mr)与预期相符, Western blotting 方法进一步证实其为目的蛋白。酶切实验初步鉴定了 SENP1C 和 SENP2C 的酶切特异性。以上蛋白的原核表达为荧光 共振能量转移实验奠定了实验基础。 : 小泛蛋白样修饰物, 小泛蛋白样修饰物特异性蛋白酶, 小泛蛋白样修饰物双荧光融合蛋白, 原核表达 , 纯化 Prokaryotic expression and identification of dual-fluorescence fusion proteins of small ubiquitin-like modifier and sentrin-specific protease 1* 2* 1 1 1 1 2 Xiaohui Wang , Jie Guo , Jufang Wang , Shan Li , Lihua Sun , Xiaoning Wang , and Jianxin Lü 1 School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China 2 Wenzhou Medical College, Wenzhou 325035, China Abstract: We clo