骨形成蛋白7基因诱导人肝癌细胞的凋亡 - 生物通.pdf

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（１１）：７～１１ 骨形成蛋白７基因诱导人肝癌细胞的凋亡  肖时湘 　张　宁 （天津市第三中心医院　天津　３００１７０） 摘要　目的：构建表达重组人骨形成蛋白７（ｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃｐｒｏｔｅｉｎ７，ＢＭＰ７）基因的重组逆转 录病毒，观察其对人肝癌细胞ＨｅｐＧ２的凋亡诱导活性，并探讨其作用机制。方法：克隆ＢＭＰ７基 因，以ｌｏｘＰ同源重组法构成逆转录病毒载体ｐＬＰＬＮＣＸＢＭＰ７（ｐＬＬＢＭＰ７），转染包装细胞ＰＴ６７进 行病毒包装并测定病毒滴度；将逆转录病毒感染人成骨细胞，ＭＴＴ法检测细胞生长变化，琼脂糖 凝胶电泳和流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ检测ＢＭＰ７，ｃａｓｐａｓｅ３和ｂｃｌ２蛋白 表达。结果：重组逆转录病毒载体ｐＬＬＢＭＰ７经鉴定连接正确，转染ＰＴ６７细胞后上清液中可得到 ９ 病毒，滴度达 １×１０ｐｆｕ／ｍｌ；ＭＴＴ检测见 ｐＬＬＢＭＰ７病毒组４８ｈ和７２ｈ细胞抑制率高于对照组 （３５．１％ｖｓ．５．３％，６８．５％ｖｓ．１８．３％，均ｐ＜０．０５），４８ｈ可见ＢＭＰ７蛋白高表达。琼脂糖凝胶电 泳出现典型梯形条带；流式细胞仪检测出现凋亡峰，于转染４８ｈ后达最高峰，其凋亡百分率高达 １４．４２％；ＢＭＰ７蛋白高表达时ｃａｓｐａｓｅ３蛋白的表达亦有显著升高，但 ｂｃｌ２蛋白未见表达差异。 结论：构建了ＢＭＰ７逆转录病毒，在体外能够有效地诱导人肝癌细胞ＨｅｐＧ２的凋亡，其可能是通 过激活ｃａｓｐａｓｅ３而发生作用。 关键词　骨形成蛋白７基因　逆转录病毒　肝癌细胞　凋亡 中图分类号　Ｑ７８９ 　　骨形成蛋白（ｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＭＰ）广泛 脂质体购自ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；限制性内切酶购自Ｇｉｂｃｏｌ 存在于人体多种组织和细胞内，并参与胚胎的发生和 ＢＲＬ公司；ＤＮＡ凝胶回收试剂盒和病毒ＤＮＡ提取试剂 发育，组织细胞的分化和增殖。目前已知有 １６种不同 盒均购自上海生工生物工程公司；鼠抗人ＢＭＰ７抗体购 的人骨形成蛋白ｃＤＮＡ得到克隆，在ＢＭＰ家族中具有 自Ｓａｎｔａ公司；细胞凋亡 ＤＮＡＬａｄｄｅｒ提取试剂盒购自 较强功能活性者为ＢＭＰ２、ＢＭＰ４和ＢＭＰ７，其主要是 博大科技公司。 通过受体传递信号而诱导凋亡是其发挥作用的重要方 １．２　引物设计与合成 ［１］ 　 　 ＢＭＰ７全 基 因序 列 的 ＧｅｎＢａｎｋ 目录号 为 式 。本实验构建 ＢＭＰ７基 因逆转录病毒载体 ｐＬＬＢＭＰ７，观察了其在体外诱导人肝癌细胞 ＨｅｐＧ２的 ＡＦ２５７７７５，利用引物设计软件ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０进行 凋亡作用，从而为ＢＭＰ７选择性诱导细胞凋亡分子机制 引物设计，其序列如下： 的进一步研究打下基础。 　　ＢＭＰ７Ｆ：５′ＧＡＡＧＴＴＡＴＣＡＧＴＣＧＡＣＡＴＧＣＡ ＴＡＣＴＣＡＴＣＡＧＧＡＣＴＴＴＣＡ３′３９ｂａｓｅ １　材料与方法 　　ＢＭＰ７Ｒ：５′ ＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＴＴ １．１　材　料 ＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＣＡＴ３′３７ｂａｓｅ 　　模板质粒ｐＵＣＢＭＰ７，由中国科学院研究生院生命 １．３　ＲＴＰＣＲ法克隆ＢＭＰ７基因 科学学院惠赠；人肝癌细胞 ＨｅｐＧ２，购自中科院上海细 　　健康成人外周血分离白细胞，采用 ＵｎｉＱ柱式总 胞库。流式细胞仪为美国ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏ