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2013-06-15 承担单位：福建省农科院农业生物资源研究所 试验设计： 试验项目：BL21菌体状态对Cry2Ab蛋白表达的影响 试验人员：许炼 试验负责：朱育菁、潘志针 报告日期：2013-07-05 计数月份：2013年月 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设计，实施实验，记载，分析清晰，结论清晰文献完整，发表水平 福建省农业科学院农业生物资源研究所 农业微生物研究中心 电话: 0591 传真: 0591试验目的 苏云金芽胞杆菌( Bacillus thuringiensis) 是1901年由日本生物学家ShigetaneIshiwatari最先发现的，属好气性蜡状芽胞杆菌群，现已发现数千种菌株，可产生内毒素(伴胞晶体，即Cry 蛋白) 和外毒素(α、β和γ外毒素) 两大类毒素[1]，其中，Cry蛋白是研究最多，杀虫机理最透彻的杀虫蛋白之一。 近年来，利用原核表达研究Cry蛋白的技术得到了广泛的应用王桂荣[2]等运用RACE技术克隆了编码棉铃虫中肠钙粘蛋白的完整cDNA并表达得到了蛋白，同时还发现该蛋白能和Cry1Ac特异性结合，证实了棉铃虫中肠钙粘蛋白是苏云金芽胞杆菌Cry1Ac的受体，并推测钙粘蛋白表达量降低是棉铃虫对Cry1Ac产生抗性的主要原因之一。周琴[3]等将GFP基因连接不同Cry基因启动子，构建重组载体，转化苏云金芽孢杆菌后发现不同的Cry启动子的表达有很大差异。利用大肠杆菌进行原核表达，一个最基本的前提条件是要确保表达菌处于对数生长期，同时，诱导剂IPTG的浓度，诱导时间，诱导温度，转数等也是需要考虑的因素；此外，利用大肠杆菌表达外源基因常常形成不溶性的无活性包涵体，包涵体的形成已经成为研究和应用活性蛋白质生产的主要障碍[4,5]。总之，影响原核表达的因素非常多。 本实验克隆了福建省农科院分离的具有高毒力的Cry2Ab基因，通过实验发现菌的状态对于表达蛋白十分关键，当菌液的OD600在0.6-0.8之间时，蛋白能够得到很好的表达，过高或过低的OD均对蛋白表达产生影响。 试验方法 含有重组质粒pET30-a(+)-Cry2Ab的BL21。 Kanamycin-LB液体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，去离子水定容至于1000 mL，灭菌后卡那霉素至终浓度为35μg/ml4℃保存。 APS(电泳级)、TEMED（电泳级）、IPTG购自泰京生物技术有限公司；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺酵母提取物和胰化蛋白胨购自OXOID公司 2.1.4 仪器 PowerPac垂直电泳仪（BIORAD）， Centrifuge 5418R（。 2.2.1 BL21菌体蛋白的获取晚上将含有pET30-a(+)-Cry2Ab重组质粒的BL21菌液μL接种到10mL LB-KANA液体培养基，180rpm、37℃过夜。第二天吸取100μl菌液，重新接种到mL LB-KANA液体培养基，220rpm、37℃培养3h，此时菌液的OD值约在0.6-1.0之间。将6mL菌液分成两管，一管加IPTG至终浓度为1mmol/L，一管加相同体积的LB-KANA液体培养基作为空白对照，37℃诱导3h。菌液000rpm离心3min，菌体加0μl 2×loading buffer和0μl的去离子水，混匀后煮沸10分钟。13000rpm离心10min，上清分装成20μl后-80℃存储。2.2.2 SDS检测Cry2Ab蛋白 带有His标签分子量在65-70KD，根据分子生物克隆指南，SDS选用10%的分离胶。μL时蛋白量比较多，导致蛋白都黏在一起，不好分开，因此选用10μL作为上样量。 浓缩胶和分离胶的配方如下： 浓缩胶 去离子水 1.9mL 30%Acr-Bis 1.7mL 1.5mol/L Tris-Hcl，PH 8.8 1.3mL 10%SDS 50μL 10%AP 50μL TEMED 3μL Total 5mL 分离胶（10%） 去离子水 1.4mL 30%Acr-Bis 0.33mL