生物素化荧光素酶的克隆表达及其固定化研究.pdf

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，２７（９）：４１～４６ 生物素化荧光素酶的克隆表达及其固定化研究 １，２ １ １，３ 戎晶晶 　陈之遥 　周国华 （１华东医学生物技术研究所　南京　２１０００２） （２中国药科大学生命科学与技术学院　南京　２１０００９　３南京大学医学院　南京　２１００１９） 摘要　为了在体内实现萤火虫荧光素酶的生物素酰化修饰，将大肠杆菌中编码生物素羧基载体 蛋白（ｂｉｏｔｉｎｃａｒｂｏｘｙｌｃａｒｒｉｅｒｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＣＣＰ）Ｃ端 ８７个氨基酸的功能域基因融合到萤火虫 （Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａｐｅｃｔｏｒａｌｉｓ）荧光素酶 ｃＤＮＡ的末端。经大肠杆菌生物素合成酶（ｂｉｏｔｉｎｈｏｌｏｅｎｚｙｍｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）的催化，生物素与ＢＣＣＰ上特定的赖氨酸（Ｌｙｓ）残基共价结合，由此与 ＢＣＣＰ融合的萤 火虫荧光素酶间接实现了生物素化的修饰。利用生物素与配体亲和素或链霉亲和素的特异性耦 合，可以将荧光素酶固定到亲和素或链霉亲和素包被的磁珠上，从而使荧光检测的应用更加灵活 和方便。讨论了生物素化荧光素酶的克隆、表达以及功能检测。 关键词　荧光素酶　生物素羧基载体蛋白　生物素酰化　融和表达　固定化 中图分类号　Ｑ７８９ 　　萤火虫的发光行为源于萤火虫体内荧光素酶的生 被修饰的Ｌｙｓ残基的位置和数目，并且极有可能影响到 ２＋ 物催化作用，在ＡＴＰ和Ｍｇ 的参与下，荧光素被萤火 蛋白分子的空间构象和活性，尤其当被修饰的Ｌｙｓ残基 虫荧光素酶氧化脱羧产生光子。１９８５年，ｄｅＷｅｔ等［１，２］ ［７］ 位于活性中心的时候 。而后者是将一段可以在体内 首次克隆了北美萤火虫Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ的荧光素酶基因，并 被生物素酰化的肽段融合到目的蛋白分子上，对目的 在大肠杆菌中得到表达。如今，荧光素酶的发光特性 蛋白进行间接的生物素修饰。生物素羧基载体蛋白 已经在科研和商业中得到了充分的应用，比如利用萤 （ＢＣＣＰ）是大肠杆菌中唯一的生物素受体，经生物素连 火虫荧光素酶ｃＤＮＡ开发的报告基因系统，以及利用荧 接酶的催化，生物素被共价连接到 ＢＣＣＰ特定的残基 －１３ 光素酶对 ＡＴＰ检测的高灵敏度（１０ ｍｏｌ）进行 ＤＮＡ Ｌｙｓ１２２的 －ＮＨ 上［８～１１］。ＢＣＣＰ８７是位于该蛋白Ｃ ε ２ ［３～５］ 焦测序、微生物控制等 。为了在一些高通量发光检 端接受生物素的功能域，其结构已经通过核磁共振和Ｘ 测中方便大规模上样和操作的自动化，将荧光素酶与 ［１２～１４］ 晶体衍射测得 。 磁珠等固相介质结合，不仅可以使荧光素酶反复得到 　　在前期 的实验 中，我们从萤火虫 Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ 利用，而且易于固液相分离。 ｐｅｃｔｏｒａｌｉｓ的发光器组织中获得了荧光素酶ｃＤＮＡ基因， 　　荧光素酶的固定化可以通过生物素酰化荧光素酶 并将其克隆到大肠杆菌中获得了高表达且具有活性的 来实现，荧光素酶被生物素修饰之后就可以同亲和素 荧光素酶，该序列已经被我们提交到ＧｅｎＢａｎｋ，登录号 进行固相亲和作用。生物素与亲和素（或链霉