蛋白质纯化及结晶的原理.doc

蛋白质纯化与结晶的原理获得蛋白质的晶体结构的第一个瓶颈，就是制备大量纯化的蛋白质(10 mg)，其浓度通常在10 mg/ml 以上，并以此为基础进行结晶条件的筛选。运用重组基因的技术，将特定基因以选殖(clone)的方式嵌入表现载体(expression vector)内，此一载体通常具有易于调控的特性。之后再将带有特定基因的载体送入可快速生长的菌体中，如大肠杆菌(Escherichia coli)，在菌体快速生长的同时，也大量生产表现载体上的基因所解译出之蛋白质。一般而言纯度越高的蛋白质比较有机会形成晶体，因此纯化蛋白质的步骤就成为一个重要的决定因素。在取得高纯度的蛋白质溶液后，接下来就是晶体的培养。蛋白质晶体与其他化合物晶体的形成类似，是在饱和溶液中慢慢产生的，每一种蛋白质养晶的条件皆有所差异，影响晶体形成的变量很多，包含化学上的变量，如酸碱度、沈淀剂种类、离子浓度、蛋白质浓度等；物理上的变数，如溶液达成过饱和状态的速率、温度等；及生化上的变数，如蛋白质所需的金属离子或抑制剂、蛋白质的聚合状态、等电点等，皆是养晶时的测试条件。截至目前为止，并无一套理论可以预测结晶的条件，所以必须不断测试各种养晶溶液的组合后，才可能得到一颗完美的单一晶体(图一) 。蛋白质晶体的培养，通常是利用气相扩散法(Vapor Diffusion Method) 的原理来达成；也就是将含有高浓度的蛋白质(10-50 mg/ml)溶液加入适当的溶剂，慢慢降低蛋白质的溶解度，使其接近自发性的沈淀状态时，蛋白质分子将在整齐的堆栈下形成晶体。举例来说，我们将蛋白质溶于低浓度(~1.0 M) 的硫酸铵溶液中，将它放置于一密闭含有高浓度(~2.0 M)硫酸铵溶液的容器中，由气相平衡，可以缓慢提高蛋白质溶液中硫酸铵的浓度，进而达成结晶的目的(图二)。蛋白质晶体在外观上与其他晶体并无明显不同之处，但在晶体的内部，却有很大的差异。一般而言，蛋白质晶体除了蛋白质分子外，其他的空间则充满约40 %至60 %之间的水溶液，其液态的成分不仅使晶体易碎，也容易使蛋白质分子在晶格排列上有不规则的情形出现，造成晶体处理时的困难及绕射数据上的搜集不易等缺点。但也由于高含水量的特性，让蛋白质分子在晶体内与水溶液中的状态，极为相似。所以由晶体所解出的蛋白质结构，基本上可视为自然状态下的结构蛋白质结构解析的方法简介 到目前为止，蛋白质结构解析的方法主要是两种，x射线衍射和NMR。近年来还出现了一种新的方法，叫做Electron Microscopy。其中X射线的方法产生的更早，也更加的成熟，解析的数量也更多，我们知道，第一个解析的蛋白的结构，就是用x晶体衍射的方法解析的。而NMR方法则是在90年代才成熟并发展起来的。这两种方法各有优点和缺点。 首先来说一下，这两种方法的一般的步骤和各自的优点和缺点。电子显微镜（electron microscopy）作为一种新型的技术，目前的应用还是非常少，并且比较狭窄，我可能等到最后在给它作些介绍，而且相信绝大多数人也没有听说过，也不会有很大的兴趣。首先是X晶体衍射。首先要得到蛋白质的晶体。通常，都是将表达蛋白的基因PCR之后克隆到一种表达载体中，然后在大肠杆菌中诱导表达，提纯之后摸索结晶条件，等拿到晶体之后，工作便完成的80％，将晶体进行x射线衍射，收集衍射图谱，通过一系列的计算，很快就能得到蛋白质的原子结构。用x射线的优点是：速度快，通常只要拿到晶体，甚至当天就能得到结构，另外不受大小限制，无论是多大的蛋白，或者复合体，无论是蛋白质还是RNA、DNA，还是结合了什么小分子，只要能够结晶就能够得到其原子结构。所以x射线方法解析蛋白的瓶颈是摸索蛋白结晶的条件。这个时候运气就显的特别重要。关于这个有好多有趣的离子。据说国外一个同学在摸索两个月无果之后，毅然去度假，就将蛋白扔在一个很随便的地方，等度假回来之后，却发现已经结晶了。 然后，来说一下NMR。NMR（nuclear magnetic resonance）现象早已发现了很久，然后将这种方法用来解析蛋白结构，却是近一二十年的事情。不过到今天为止，用nmr方法来解析结构已经十非常成熟的方法。原理暂且放在一边，先说常规步骤。首先通过基因工程的方法，表达出目的蛋白，提纯之后，摸索一下蛋白稳定的条件，如果蛋白没有聚合，而且折叠良好，便将蛋白样品（通常是1mM－3mM，500ul，Ph6－7的PBS）装入核磁管中，放入核磁谱仪中，然后用一系列写好的程序控制谱仪，发出一系列的电磁波，激发蛋白中的H、N13、C13原子，等电磁波发射完毕，在收集受激发的原子所放出的“能量”，其实也是小磁场，通过收集数据、谱图处理、电脑计算从而得到蛋白的原子结构。它的优点就是，蛋白在液体中得到结构，是一个动